馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）已成為了繼小麥、水稻、玉米后的世界第四大糧食作物。馬鈴薯在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)遭受多種病害,嚴(yán)重影響其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。抵抗病原菌時(shí),蛋白質(zhì)之間會(huì)發(fā)生相互作用,共同完成抗病相關(guān)信號(hào)的傳遞。泛素/26S蛋白酶體是重要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng),可以清除脅迫條件下產(chǎn)生的垃圾蛋白,從而維持細(xì)胞的正常功能。E3泛素連接酶作為蛋白酶體系統(tǒng)的重要組成部分,特異性的識(shí)別其靶標(biāo)蛋白,參與后續(xù)蛋白質(zhì)的降解過(guò)程。實(shí)驗(yàn)室用馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）、青枯菌（Ralstonia solanacearum）、致病疫霉（Phytophtora infestans）侵染野生型馬鈴薯,發(fā)現(xiàn)有多個(gè)編碼E3泛素連接酶的基因受病菌高水平誘導(dǎo)表達(dá)。本研究克隆出受誘導(dǎo)表達(dá)水平較高的基因,命名為St ATL80;對(duì)其在抵抗病害時(shí)發(fā)揮的功能進(jìn)行研究。主要的研究結(jié)果與結(jié)論如下:（1）St ATL80的生物信息學(xué)分析設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增得到St ATL80基因。測(cè)序結(jié)果顯示,St ATL80全長(zhǎng)為513bp,編碼171個(gè)氨基酸。St ATL80與其它物種ATL家族成員均有較近的親緣關(guān)系;因... 

【文章來(lái)源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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目的基因StATL80的克隆1-3：StATL80基因的PCR擴(kuò)增；4：陰性對(duì)照M：DL2000

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文33圖3-2StATL80生物信息學(xué)分析（A）StATL80蛋白質(zhì)空間三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，紅色箭頭所指為Ring環(huán)結(jié)構(gòu)；（B）ATL家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；（C）StATL80與其它物種ATL家族同源性比對(duì)。Fig.3-2StATL80bioinformaticsanalysis(A)Predictionofthethree-dimensionalstructureofStATL80proteinspace,theredarrowindicatestheRingstructure;(B)ATLfamilyproteinphylogenetictree;(C)StATL80homologyratiowithotherspeciescorrect.3.2StATL80在地上組織表達(dá)且響應(yīng)多種脅迫以四周苗齡的野生型馬鈴薯為實(shí)驗(yàn)材料，研究StATL80基因的組織表達(dá)模式。分別選取野生型馬鈴薯的根、莖、葉、塊莖等組織并對(duì)StATL80基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)StATL80基因在葉中的表達(dá)量最高，其次是在莖中，而在塊莖及根中的表達(dá)量比較低（如圖3-3A所示），StATL80的表達(dá)差異性說(shuō)明其主要在地上組織發(fā)揮功能。為了分析StATL80基因的誘導(dǎo)表達(dá)模式，研究StATL80可能參與的信號(hào)分子途徑，用水楊酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）處理四周苗齡且長(zhǎng)勢(shì)良好的野生型馬鈴薯葉片，在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)（0h、6h、120h、24h、48h、72h）取材，提取RNA，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是水楊酸（SA）還是茉莉酸甲酯（MeJA）處理后，StATL80基因的表達(dá)量均明顯上升（如圖3-3B，3-3C所示），在處理時(shí)間為第48h的時(shí)候，StATL80基因的表達(dá)量達(dá)到最高水平，之后表達(dá)量又逐漸下降，結(jié)果說(shuō)明，StATL80基因在轉(zhuǎn)錄水平

馬鈴薯E3泛素連接酶基因StATL80的克隆與功能分析34能以較快的速度響應(yīng)多種激素的刺激，證明它在植物的激素響應(yīng)應(yīng)答過(guò)程中可能發(fā)揮重要的作用。圖3-3StATL80表達(dá)模式（A）StATL80組織特異性分析；（B）StATL80在激素SA誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)模式分析；（C）StATL80在激素MeJA誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)模式分析，Bar值代表標(biāo)準(zhǔn)差，顯著性分析運(yùn)用雙側(cè)t檢驗(yàn)，（*P≤0.05）。Fig.3-3StATL80expressionpattern(A)StATL80tissue-specificanalysis;(B)StATL80expressionpatternanalysisduringhormoneSAinduction;(C)StATL80expressionpatternanalysisduringhormoneMeJAinduction,theBarvaluerepresentsthestandarddeviation,andatwo-sidedttestwasusedforsignificanceanalysis(*P≤0.05).3.3StATL80超表達(dá)和RNAi轉(zhuǎn)基因株系的獲得首先，構(gòu)建StATL80超表達(dá)載體（StATL80-OE）以及RNAi載體，成功將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到GV3101農(nóng)桿菌中，選取馬鈴薯品種“鄂薯3號(hào)”作為轉(zhuǎn)基因受體材料，將已侵染的馬鈴薯莖段部位愈傷組織共培養(yǎng)大約3-5d，轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)大約7-9d，培養(yǎng)條件為25℃，讓它產(chǎn)生新的愈傷組織，此時(shí)沒(méi)有成功轉(zhuǎn)化到重組植物表達(dá)載體的愈傷組織則不會(huì)在含有抗生素的培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)，它們會(huì)在選擇培養(yǎng)基上發(fā)生褐變從而死亡；長(zhǎng)勢(shì)較好的愈傷組織在溫室培養(yǎng)10d后，將成功生長(zhǎng)起來(lái)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到TS2A分化培養(yǎng)基中，進(jìn)一步誘導(dǎo)讓愈傷組織產(chǎn)生芽（如圖3-4所示）。


本文編號(hào)：3566612