發(fā)布時(shí)間：2017-05-11 04:04

  本文關(guān)鍵詞：胰腺炎型鴨1型甲肝病毒VP1蛋白單克隆抗體的制備，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本試驗(yàn)病原為胰腺炎型DHAV-1(MPZJ1206株),其所引起的病變與典型的DHAV-1有所不同,主要引起雛番鴨發(fā)生病變,發(fā)病的雛番鴨胰腺可見(jiàn)發(fā)黃和出血。將胰腺炎型DHAV-1與GenBank中登錄的DHAV-1相比,發(fā)現(xiàn)其VP1基因核苷酸同源性在94.1%與99.1%之間,VP1基因推導(dǎo)氨基酸殘基的同源性在96.8%與97.5%之間。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)MPZJ1206株的VP1基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,并采用RT-PCR法將目的VP1基因擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后,將其連接到克隆載體pMD18-T上,構(gòu)建克隆載體pMD18-T-VP1,并將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli Trans5α。挑取單菌落,雙酶切鑒定并測(cè)序,將鑒定為陽(yáng)性的菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,回收VP1片段,將其與表達(dá)載體pGEX-6P-1進(jìn)行連接。并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,鑒定同上,將鑒定為陽(yáng)性的菌落經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,并對(duì)其進(jìn)行了鑒定。在此基礎(chǔ)上對(duì)VP1蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,表達(dá)的目的蛋白大小為53kDa,與預(yù)期相符,且具有反應(yīng)原性,37℃誘導(dǎo)表達(dá)5h蛋白表達(dá)量達(dá)到最大,主要以包涵體的形式存在。將誘導(dǎo)表達(dá)的VP1蛋白作為抗原免疫BALB/C、鼠,共免疫四次。同時(shí)建立檢測(cè)小鼠抗VP1抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。最后一次免疫后72h內(nèi)取處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。融合后的雜交瘤細(xì)胞采用間接ELISA篩選陽(yáng)性克隆,并進(jìn)行亞克隆,結(jié)果共獲得的2株雜交瘤細(xì)胞株均能穩(wěn)定分泌抗DHAV-1的VP1蛋白單克隆抗體,分別命名為1A2、5G3,并對(duì)其穩(wěn)定性,小鼠腹水的效價(jià)等進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)表明,兩株單克隆抗體具有穩(wěn)定性好,效價(jià)較高,特異性良好的特點(diǎn)。1A2株效價(jià)可達(dá)1：25×103,5G3株效價(jià)可達(dá)1：211×103。亞類(lèi)鑒定結(jié)果顯示,兩株細(xì)胞均為IgG1、κ鏈抗體。Western-blot表明兩株單克隆抗體是針對(duì)DHAV-1的VP1蛋白。本實(shí)驗(yàn)獲得的單克隆抗體為DHAV-1的治療以及研制試劑盒對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)打下了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：胰腺炎型DHAV-1 VP1蛋白 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-20
• 1.1 DHAV-1的流行特點(diǎn)及分布情況11-12
• 1.2 鴨1型甲肝病毒的理化特性及生物學(xué)特性12-13
• 1.3 鴨1型甲型肝炎病毒的特性和基因組結(jié)構(gòu)13-15
• 1.3.1 鴨1型甲肝病毒非編碼區(qū)14
• 1.3.2 鴨1型甲肝病毒編碼區(qū)14-15
• 1.4 鴨1型甲肝病毒的檢測(cè)方法15-17
• 1.4.1 中和試驗(yàn)15
• 1.4.2 HA和HI試驗(yàn)15
• 1.4.3 ELISA試驗(yàn)15-16
• 1.4.4 熒光抗體法16
• 1.4.5 膠體金法16
• 1.4.6 RT-PCR技術(shù)16-17
• 1.4.7 PCR-DHPLC17
• 1.4.8 RT-LAMP17
• 1.5 單克隆抗體技術(shù)17
• 1.6 小結(jié)17-20
• 2. 胰腺炎型DHAV-1的VP1基因的原核表達(dá)及鑒定20-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑20-21
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)病毒及試劑20
• 2.1.2 常用溶液的配置20-21
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-25
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)21
• 2.2.2 目的基因的PCR擴(kuò)增21-23
• 2.2.3 PCR產(chǎn)物的回收與克隆23-24
• 2.2.4 VP1重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化24-25
• 2.2.5 VP1蛋白的可溶性分析25
• 2.2.6 VP1蛋白的Western-blot鑒定25
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-31
• 2.3.1 VP1蛋白抗原表位的預(yù)測(cè)及序列分析25-26
• 2.3.1.1 VP1蛋白的抗原預(yù)測(cè)25-26
• 2.3.1.2 VP1蛋白的親水性結(jié)構(gòu)26
• 2.3.1.3 VP1蛋白的表面概率結(jié)構(gòu)26
• 2.3.2 VP1基因的PCR擴(kuò)增及雙酶切鑒定26-28
• 2.3.3 VP1蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化28-29
• 2.3.4 VP1蛋白的可溶性分析結(jié)果29-30
• 2.3.5 胰腺炎型鴨1型甲肝病毒VP1蛋白的Western-blot檢測(cè)30-31
• 2.4 討論31-32
• 3. 胰腺炎型鴨1型甲肝病毒VP1蛋白單克隆抗體的制備32-49
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑32-33
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物32
• 3.1.2 主要試劑32
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)用液32-33
• 3.1.4 儀器設(shè)備33
• 3.2 單克隆抗體的制備33-39
• 3.2.1 小鼠的免疫33
• 3.2.2 胰腺炎型DHAV-1抗體的間接ELISA檢測(cè)方法的建立33-35
• 3.2.3 飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備35
• 3.2.4 骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備35-36
• 3.2.5 脾細(xì)胞的制備36
• 3.2.6 細(xì)胞融合36-37
• 3.2.7 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆37
• 3.2.8 雜交瘤細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇37-38
• 3.2.9 雜交瘤細(xì)胞的鑒定38
• 3.2.10 單克隆抗體腹水制備38-39
• 3.2.11 單克隆抗體腹水效價(jià)測(cè)定39
• 3.3 結(jié)果與分析39-47
• 3.3.1 檢測(cè)胰腺炎型DHAV-1抗體的間接ELISA的建立39-42
• 3.3.1.1 純化的胰腺炎型鴨1型甲肝病毒的蛋白定量39
• 3.3.1.2 最佳抗原稀釋度及最佳血清稀釋度的確定39-40
• 3.3.1.3 抗原最佳包被條件的確定40
• 3.3.1.4 最佳血清工作時(shí)間的確定40-41
• 3.3.1.5 酶標(biāo)二抗最佳工作時(shí)間的確定41
• 3.3.1.6 臨界值的確定41
• 3.3.1.7 免疫小鼠血清中的肝炎抗體效價(jià)水平的測(cè)定41-42
• 3.3.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立42-43
• 3.3.3 穩(wěn)定性鑒定結(jié)果43-44
• 3.3.4 雜交瘤細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)44
• 3.3.5 Western-blot鑒定結(jié)果44-45
• 3.3.6 單克隆抗體的鑒定結(jié)果45-47
• 3.4 討論47-49
• 3.4.1 抗原的選擇與制備47
• 3.4.2 免疫動(dòng)物的選擇47
• 3.4.3 免疫彟的確定47
• 3.4.4 飼養(yǎng)細(xì)胞47-48
• 3.4.5 細(xì)胞融合48
• 3.4.6 單克隆抗體效價(jià)比較48-49
• 4 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 附錄56-61
• 致謝61

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本文編號(hào)：356188