MicroRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA,通常在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá),在植物生長發(fā)育的每個階段都發(fā)揮著不可或缺的作用。miR156是一類進(jìn)化上高度保守的miRNA家族之一,馬鈴薯Stu-miR156包含11個成員,調(diào)控靶基因SPL家族廣泛參與植物的生長發(fā)育、激素應(yīng)答、逆境脅迫響應(yīng)和光合作用等代謝過程。但關(guān)于miR156對馬鈴薯生長發(fā)育和響應(yīng)干旱脅迫的研究很少。本研究通過amiRNA技術(shù)和STTM技術(shù)構(gòu)建馬鈴薯Stu-miR156過表達(dá)載體和沉默表達(dá)載體Stu-miR156STTM,轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培品種“Desiree”獲得轉(zhuǎn)基因植株。qRT-PCR分析轉(zhuǎn)基因植株中Stu-miR156及靶基因StSPL9的表達(dá)量,統(tǒng)計分析側(cè)根數(shù)量及側(cè)根長度,為進(jìn)一步研究miR156/SPLs模塊參與調(diào)控馬鈴薯側(cè)根發(fā)育提供理論依據(jù)。本研究取得的主要結(jié)果如下:1.馬鈴薯Stu-miR156生物信息學(xué)分析表明有11條前體序列,加工形成16條成熟序列。通過靶基因在線預(yù)測工具psRNATarget發(fā)現(xiàn)靶基因StSPL9第1296-1316個堿基處被Stu-miR156靶向結(jié)合。2.構(gòu)建... 

【文章來源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

植物miRNA的生物合成（Parketal.,2002;Baumbergeretal.,2003）

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士學(xué)位論文6進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在IPS1與miR399成熟序列5’端互補(bǔ)配對結(jié)合的第10-11個堿基之間有三個堿基（CUA）的凸起，形成不完全互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。因此IPS1不能被miR399-RISC復(fù)合體的成熟發(fā)夾結(jié)構(gòu)剪切，從而有效阻斷miR399對IPS1RNA的切割，參與調(diào)控磷的動態(tài)平衡。Franco-Zorrilla等模擬miR399/IPS1的作用方式，設(shè)計并開發(fā)了miRNA的靶基因模擬序列（Targetmimicry,TM）技術(shù)[42]。短串聯(lián)靶標(biāo)模擬物（Shorttandemtargetmimic,STTM）技術(shù)是在TM技術(shù)的理論基礎(chǔ)上，由Yan等[43]優(yōu)化設(shè)計出的一種可以高效性和特異性降低miRNA的表達(dá)水平。可通過轉(zhuǎn)化或基于病毒的瞬時表達(dá)系統(tǒng)將其引入植物中，同時有效阻斷miRNA家族的所有成員，探索單個miRNA和多個miRNA間互相作用的功能成為可能[44]。STTM是模擬成熟miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)自身的骨架，設(shè)計出由一段特定的31、48和88個核苷酸的間隔子將兩段miRNA的結(jié)合序列連接起來，從而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。大量試驗證明，當(dāng)間隔子為48個核苷酸時，對靶miRNA的表達(dá)量影響效果最明顯。因此，48個核苷酸形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)應(yīng)用于STTM技術(shù)中。在這兩個結(jié)合位點與靶標(biāo)miRNA第10-11個堿基互補(bǔ)位點處有3個堿基（CTA）的凸起，這3個錯配的堿基有效阻止miRNA與靶基因的完全互補(bǔ)結(jié)合，而不被RISC剪切。被STTM結(jié)合的目標(biāo)miRNA可能被SDN降解，導(dǎo)致目標(biāo)miRNA的沉默和靶基因的積累[45]。Yan就miR156/166-48nt設(shè)計出了如圖1.2所示的STTM結(jié)構(gòu)。圖1.2STTM結(jié)構(gòu)的工作模型（Yanetal.,2012；Tangetal.,2012）Fig.1.2theworkmodelofSTTMStructure（Yanetal.,2012;Tangetal.,2012）1.2.2STTM的研究進(jìn)展為了更好研究miRNA的功能，自Yan等[43]在TM技術(shù)的基礎(chǔ)上改良出STTM

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士學(xué)位論文8目前在擬南芥中已廣泛研究了miR156-SPL調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育功能，發(fā)現(xiàn)有8個成員，其前體分別是miR156（a-h），在馬鈴薯中miR156有11個成員。在水稻中有19個SPL基因家族成員，其中有11個被miR156靶向[58]；擬南芥miR156靶向17個SPL家族中的11個基因[59]。根據(jù)其功能分為三類：（1）SPL2，SPL9，SPL10，SPL11，SPL13和SPL15主要調(diào)控從幼苗期到成熟期的過渡，其中SPL10在側(cè)根起始位點表達(dá)，而SPL9在側(cè)根分生組織區(qū)特異性表達(dá)并通過直接結(jié)合miR172b啟動子調(diào)控miR172的表達(dá)，從而調(diào)控AGAMOUS-likeMADSboxprotein79(AGL79)轉(zhuǎn)錄因子參與抑制側(cè)根的生長發(fā)育，并調(diào)控開花時間；（2）SPL3，SPL4和SPL5參與促進(jìn)花的分生組織；（3）SPL6可能參與調(diào)節(jié)某些生理過程，但其確切功能仍未完全闡明[60]。在不同植物物種中，miR156調(diào)控SPL家族中的不同成員參與多種發(fā)育過程。如參與種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育[61]、葉片和質(zhì)體發(fā)育[61-63]、毛狀體的形成和分布[64]、幼苗時期到花期和成熟期的階段性過渡[65-69]、果實成熟[70]、谷物產(chǎn)量[71]甚至參與程序性細(xì)胞死亡（圖1.3）[72]。圖1.3miR156調(diào)控植物生長發(fā)育Fig.1.3miR156regulatesplantgrowthanddevelopment1.3.1miR156調(diào)控植物側(cè)根發(fā)育植物根系的形態(tài)受到多種因素的調(diào)節(jié)，側(cè)根是植物的重要農(nóng)藝性狀，具有吸收和運(yùn)輸養(yǎng)分和水分以及穩(wěn)固植物的功能[73,74]。近年來研究發(fā)現(xiàn)側(cè)根發(fā)育受磷脅迫、乙烯、生長素等因素的影響。miR156調(diào)控SPL基因抑制不定根的發(fā)≧育，

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本文編號：3561746