布魯氏菌�。˙rucellosis,簡稱“布病”）是由胞內(nèi)寄生菌——布魯氏菌（Brucella spp.）引起的一種人獸共患傳染病,該病嚴重影響我國的畜牧業(yè)的發(fā)展,造成重大經(jīng)濟損失。我國目前對布魯氏菌病的檢測主要以細菌學、血清學檢測方法為主,這些方法存在著費時費力、假陽性、以及無法區(qū)分死菌等缺點,同時不能對病原進行快速檢測和種間鑒定。因此,開發(fā)布魯氏菌病快速檢測方法對布病的防控與凈化具有重要意義。本課題致力于研究布魯氏菌的快速檢測方法,以核酸擴增技術為基礎,建立一系列檢測方法,為布魯氏菌病的科學研究、防控與凈化,提供切實有效的布魯氏菌檢測技術手段。1、通過將疊氮溴化丙錠（Propidium Monoazide,PMA）與熒光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR,qPCR）結合建立一種布魯氏菌活菌數(shù)的快速定量檢測方法。以布魯氏菌單拷貝BCSP31基因為檢測靶標,構建重組標準質粒,繪制標準曲線。優(yōu)化qPCR反應條件及PMA最佳應用濃度與曝光時間,對該方法的靈敏度、特異性、重復性等進行分析。結果顯示,CT值與標準質�？截悢�(shù)濃度對數(shù)值之間線性關系良好;靈敏度為... 

【文章來源】：吉林大學吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：118 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

Bruce-ladder法對布魯氏菌進行種間鑒定[85]

第一篇文獻綜述第2章基于核酸擴增技術的檢測方法及其應用16基團，對整個擴增過程進行實時監(jiān)控，將每個擴增反應所產(chǎn)生的熒光信號進行檢測、收集，最終利用已知量的標準品構建標準曲線對未知樣本進行定量分析，實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。該技術目前常用的熒光物質主要分為探針類和染料類兩大類。1）TaqMan探針TaqMan探針是一段能與目的片段特異結合的核酸序列，如圖2所示，該序列的5"標記熒光報告基團，3"端標記淬滅基團，探針處于完整狀態(tài)時，熒光基團所釋放的熒光信號被淬滅基團所吸收。當擴增反應開始時，引物與探針都與模板鏈特異性結合，隨著擴增反應的開始，探針鏈逐漸被鏈置換反應所替代，探針將會被DNA聚合酶的5"-3"外切酶活性所水解，此時熒光基團釋放的熒光信號就會隨著擴增反應的進行被儀器監(jiān)測。熒光信號的強度達到儀器所設置的某一閾值時，此時的循環(huán)次數(shù)（CT值）就被記錄下來，CT值與目的基因拷貝數(shù)的對數(shù)值成線性關系，從而對目標物達到定量的目的[98]。圖2TaqMan探針技術作用原理[99]Fig.2TheprincipleofTaqManProbetechnology2）雜交探針（HybProbe）雜交探針是由兩個寡核苷酸探針所組成，該探針率先由羅氏公司（Roche）所發(fā)明并應用于熒光定量PCR的檢測。如圖3所示，兩個寡核苷酸探針分別標記熒光供體和熒光受體，當PCR反應退火復性時，兩個探針同與一條模板鏈進行雜交，熒光供體與熒光受體相接近，熒光供體被外來光源激發(fā)，其釋放的能量

第一篇文獻綜述第2章基于核酸擴增技術的檢測方法及其應用17通過熒光共振能量轉移（FRET）傳遞給熒光受體，而受體所釋放的熒光信號則被儀器檢測到，隨著擴增反應的進行，DNA產(chǎn)物越多，其釋放的熒光信號就越大，從而對目標物達到定量的目的圖3雜交探針技術作用原理（引自Roche公司）Fig.3TheprincipleofHybridizationProbetechnology3）分子信標探針（MulecularBeaconsProbe）分子信標探針為新型探針，該探針需要特定結構的序列，設計要求高。特點在于其為莖環(huán)狀的發(fā)卡結構，如圖4所示。該探針的莖環(huán)是由15~30個核苷酸組成，莖臂一般由5~7個核苷酸組成，其兩端序列互補配對，分別標記有熒光基團和淬滅集團。當無靶標時，探針成自由狀態(tài)，形成穩(wěn)定的莖環(huán)發(fā)卡結構，熒光基團被激發(fā)產(chǎn)生的熒光信號被淬滅集團所淬滅，當探針與模板鏈成功雜交時，可形成線性結構，熒光基團與淬滅基團間隔較遠，淬滅基團失去作用，此時所激發(fā)的熒光信號可被儀器監(jiān)測到。圖4分子信標探針技術作用原理（引自Roche公司）Fig.4TheprincipleofMulecularBeaconsProbetechnology4）熒光染料熒光染料的工作原理較簡單，如圖5所示，當熒光染料與雙鏈擴增產(chǎn)物結合時，會產(chǎn)生較強的熒光信號，進而被儀器監(jiān)測到，熒光信號的強度與反應體系內(nèi)

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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[3]基于PCR的天麻、Hg2+檢測方法及PCR結合DiSC2（5）的一步可視化檢測法的建立[D]. 王巍.成都中醫(yī)藥大學 2015
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本文編號：3493385