發(fā)布時間：2021-11-01 11:21

　　菊花（Chrysanthemum morifolium）是菊科、菊屬的多年生草本花卉,是我國的傳統(tǒng)名花,具有較高的觀賞與經(jīng)濟價值,但菊花在復雜多變的生長過程中,干旱、高溫、凍害、高鹽等逆境脅迫會影響其生長發(fā)育,甚至導致死亡。菊花白色銹病是菊花首要病害之一,尤其在溫度較低、濕度較高的環(huán)境栽培,植株發(fā)病較重,嚴重影響其產(chǎn)量與品質。近年來,隨著植物基因工程技術的發(fā)展,從分子層面上改變植物抗逆性的例子屢見不鮮,因此尋找菊花抗逆基因,通過植物遺傳工程將特異基因導入植物,進行轉基因育種,成為培育抗逆菊花新品種的一條有效途徑。本研究以菊花白色銹病抗病品種‘黃鶯’為試驗材料,利用前期克隆獲得的CmWRKY15-1基因序列,構建基因植物表達載體與干擾載體轉化菊花,實現(xiàn)該基因的過表達與沉默,驗證CmWRKY15-1基因在菊花抗白色銹病中的功能,為闡述其抗白色銹病的分子機理提供借鑒,從而提高菊花的觀賞品質。主要研究結果如下:1.農(nóng)桿菌介導法轉化菊花品種‘黃鶯’,用含有CmWRKY15-1基因表達載體pBI121-CmWRKY15-1重組質粒的農(nóng)桿菌菌液侵染葉片,建立高效的遺傳轉化體系�！S鶯’在MS+0.5... 

【文章來源】：沈陽農(nóng)業(yè)大學遼寧省

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

生長調節(jié)劑對菊花品種‘黃鶯’葉片分化的影響

第二章CmWRKY15-1基因過量表達載體的轉化20圖2-2Kan對菊花品種‘黃鶯’愈傷組織生長的影響Figure2-2Effectsofkanamycinconcentrationonleafdifferentiationofchrysanthemumvarieties‘Huangying’2.3.3遺傳轉化體系的確定本試驗采用農(nóng)桿菌介導的葉盤轉化法對菊花品種‘黃鶯’進行遺傳轉化，通過控制變量法，經(jīng)過預培養(yǎng)、共培養(yǎng)、延遲培養(yǎng)、抗性芽的分化和篩癬根的分化和生長等5個階段確立了該菊花品種的最佳遺傳轉化體系：預培養(yǎng)（MS+0.5mg·L-16-BA+0.3mg·L-1NAA）2d，侵染時菌液濃度OD600=0.5-0.6，稀釋50倍，侵染7min，共培養(yǎng)（MS+0.5mg·L-16-BA+0.3mg·L-1NAA）2d（圖2-3a），延遲培養(yǎng)（MS+0.5mg·L-16-BA+0.3mg·L-1NAA+200mg·L-1Cef）2d后，轉接至篩選培養(yǎng)基（MS+0.5mg·L-16-BA+0.3mg·L-1NAA+200mg·L-1Cef+20mg·L-1Kan）上，每15d更換一次培養(yǎng)基，直至產(chǎn)生抗性芽后接種于生根篩選培養(yǎng)基（MS+15mg·L-1Kan）中（圖2-3b和2-3c），待小苗長至5-8cm時（圖2-3d），將獲得的轉化苗移栽至花盆中，圖為整個遺傳轉化過程。abcda：共培養(yǎng)的菊花葉片；b：形成愈傷組織和篩選培養(yǎng)基長出抗性芽；c：生根培養(yǎng)；d：煉苗a：Leafdisksofco-cultured；b：TheleafdiskswithcallusformationandResistantbudsgeneratedfromtheinfectedleafdiscs；3：Rootingculture；4：Exercisingplants圖2-3抗性植株的獲得Figure2-3AcquisitionofKanamycin-resistantplants2.3.4轉基因菊花的鑒定經(jīng)過Kan篩選共獲得18株抗性植株，提取抗性苗葉片DNA，以pBI121質粒上35S啟動子特異引物nptⅡ抗性標記基因序列設計引物，進行PCR鑒定，通過對電泳（圖2-4）結果的分析，發(fā)現(xiàn)在678bp處有8株擴增出與陽性對照相一致的條帶，而陰性對照未見對應條帶，表明CmWRKY15-1已基

沈陽農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文21個菊花‘黃鶯’植株中。M：DNAmarker;W：野生型；P：pBI121陽性質粒DNA；1-18：抗性植株葉片DNAM：DNAmarker；W：Negativecontrol；P：TheplasmidofpBI121aspositivecontrol；1-18：strainsofpupativetransgenic圖2-4PCR檢測Figure2-4PCRdetection將PCR鑒定出的陽性植株進行半定量檢測，結果表明（圖2-5），CmWRKY15-1基因在轉基因株系中均有不同程度的表達，且均高于野生型植株。WT：野生型；6，7，9，10，11，13，14，16：CmWRKY15-1轉基因株系WT：wildtype；6，7，9，10，11，13，14，16：transgenicoverexpressingplantsofCmWRKY15-1圖2-5半定量檢測Figure2-5SemiquantitativeRT-PCRdetectionqRT-PCR結果顯示（圖2-6），轉基因株系9號中CmWRKY15-1的表達量最高，約為野生型植株的25倍，7號與13號次之，分別為13倍和12倍。熒光定量檢測結果與半定量結果一致，由此證明CmWRKY15-1成功高表達。WT：野生型；7，9，13，16：CmWRKY15-1轉基因株系WT：wildtype；7，9，13，16：transgenicoverexpressingplantsofCmWRKY15-1圖2-6野生型與轉基因株系中CmWRKY15-1的相對表達量Figure2-6RelativeexpressionlevelofCmWRKY15-1intransgeniclinesandWT2.3.5陽性植株的擴繁

【參考文獻】：
期刊論文
[1]農(nóng)桿菌介導的黑果枸杞遺傳轉化體系的建立[J]. 王靜,唐靜,崔悅婷,陳韻,趙會君,閆興富.  北方園藝. 2020(01)
[2]WRKY轉錄因子在植物非生物脅迫抗逆育種中的應用[J]. 司愛君,陳紅,余渝,孔憲輝,劉麗,王旭文,田琴.  江蘇農(nóng)業(yè)科學. 2019(16)
[3]菊花‘金不凋’再生及遺傳轉化體系的構建[J]. 吳志蘋,高亦珂,范敏,高耀輝.  分子植物育種. 2020(01)
[4]中國農(nóng)科院利用植物介導的RNAi方法獲得抗蚜蟲小麥[J]. 鄭慶偉.  農(nóng)藥市場信息. 2019(03)
[5]棉花WRKY22基因分離及其對黃萎病的抗性分析[J]. 雷煜,張振楠,胡廣,劉建芬,唐葉,張寧,司懷軍,吳家和.  華北農(nóng)學報. 2018(06)
[6]WRKY轉錄因子在植物抗病反應中的功能研究進展[J]. 禹陽,賈趙東,馬佩勇,郭小丁,謝一芝,邊小峰.  分子植物育種. 2018(21)
[7]RNAi技術及其在植物中的應用[J]. 伍國強,劉海龍,劉左軍.  分子植物育種. 2018(19)
[8]菊花白銹病的藥劑防治試驗[J]. 趙婭玲,馬千里,程東美.  仲愷農(nóng)業(yè)工程學院學報. 2017(04)
[9]WRKY轉錄因子在植物抗逆生理中的研究進展[J]. 文鋒,吳小祝,廖亮,劉新圣,李鵬.  廣西植物. 2017(01)
[10]過量表達棉花CBF2基因提高轉基因擬南芥抗旱耐鹽能力[J]. 陳蕓,鄭勇,劉霞,任羽,馬劉峰.  植物科學學報. 2016(06)

博士論文
[1]大麥水楊酸合成途徑及其應答赤霉菌侵染的機理研究[D]. 郝群群.山東農(nóng)業(yè)大學 2018
[2]擬南芥水楊酸通路蛋白參與植物抗生物脅迫的作用機理研究[D]. 朱杉.蘭州大學 2012

碩士論文
[1]菊花CmDREBa-2基因的同源轉化及功能驗證[D]. 李娜（Lee Na）.沈陽農(nóng)業(yè)大學 2018
[2]菊花抗白色銹病相關基因CmDREBa-2的克隆及表達分析[D]. 熊超明.沈陽農(nóng)業(yè)大學 2018
[3]CsSAMT-1基因在水楊酸信號響應柑橘黃龍病侵染中的功能研究[D]. 白曉晶.西南大學 2018
[4]菊花CmMET1基因RNAi載體的構建及對菊花和青蒿的遺傳轉化[D]. 范曉萱.河南大學 2016
[5]煙草orf25、atp9基因的RNAi載體構建及遺傳轉化[D]. 謝麗娟.江西農(nóng)業(yè)大學 2016
[6]菊花CmWRKY1和CmWRKY15基因功能初步研究[D]. 范青青.南京農(nóng)業(yè)大學 2016
[7]海島棉GbNPR1基因的表達特性及功能分析[D]. 柴蒙亮.石河子大學 2014
[8]2012年我國小麥葉銹菌生理小種鑒定及毒性分析[D]. 肖宇.河北農(nóng)業(yè)大學 2014
[9]外源性水楊酸誘導月季對黑斑病抗性的研究[D]. 金一鋒.東北農(nóng)業(yè)大學 2013
[10]水稻Hsp74.8基因的初步功能研究和兩個水稻MYB基因的過表達載體構建[D]. 王景晨.湖南農(nóng)業(yè)大學 2011



本文編號：3470023