大豆疫霉（Phytophthora sojae）屬藻物界（Chromista）卵菌門（Oomycota）菌物,雖然形態(tài)上類似絲狀真菌,但在系統(tǒng)發(fā)育和進化背景上與硅藻和藍藻接近。在田間,大豆疫霉進化迅速,毒力結(jié)構(gòu)變異頻繁,目前大豆疫霉基本已經(jīng)攻克了所有已知的大豆抗疫霉根腐病基因,急需開發(fā)新的抗性資源。因此,深入研究大豆疫霉的致病機理對于發(fā)掘分子育種新資源和設(shè)計防治策略具有重要的價值。細胞壁是植物抵抗致病菌侵染的強大物理屏障,其復雜異質(zhì)的高分子動態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是形成抗性屏障的分子基礎(chǔ)。感染初期的病原菌通常會分泌多種破壞宿主細胞的細胞壁降解酶（Cell-wall degrading enzymes,CWDEs）。纖維素是植物細胞壁的主要成分（約占40%-60%）,所以病原菌分泌的纖維素酶在細胞壁降解中起著關(guān)鍵的作用。本研究從大豆疫霉中篩選到一個新的GH7家族纖維二糖水解酶基因PsGH7a,其在大豆-疫霉菌互作初期顯著上調(diào)表達,并且酶蛋白在疫霉中高度保守。已有報道,病原菌分泌的纖維素酶是觸發(fā)植物免疫應(yīng)答的病原相關(guān)的分子模式（Pathogen-associated molecular pattern... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 大豆疫霉與植物的互作機制
        1.1.1 大豆疫霉的生物特性
        1.1.2 大豆疫霉的發(fā)病癥狀及規(guī)律
        1.1.3 大豆疫霉的致病機制
        1.1.4 大豆的抗病機制
    1.2 細胞壁在植物免疫中的作用
        1.2.1 細胞壁的結(jié)構(gòu)組分
        1.2.2 植物免疫中細胞壁的動態(tài)變化
    1.3 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)
        1.3.1 CRISPR/Cas9的研究進展
        1.3.2 卵菌CRISPR/Ca9的研究進展
    1.4 目的意義及技術(shù)路線
        1.4.1 目的意義
        1.4.2 技術(shù)路線
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 實驗菌株及植物
        2.1.2 載體和菌株
        2.1.3 常用的生化試劑
        2.1.4 試驗儀器和耗材
        2.1.5 常用培養(yǎng)基和相關(guān)溶液的配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 生物信息學分析
        2.2.2 大豆疫霉P6497總RNA的提取
        2.2.3 大豆疫霉反轉(zhuǎn)錄cDNA
        2.2.4 熒光定量分析(qRT-PCR)
        2.2.5 引物設(shè)計
        2.2.6 大豆疫霉gDNA的提取
        2.2.7 基因的克隆
        2.2.8 瓊脂糖凝膠電泳
        2.2.9 目的片段回收
        2.2.10 DNA雙酶切
        2.2.11 T4連接
        2.2.12 大腸桿菌轉(zhuǎn)化
        2.2.13 菌落PCR驗證
        2.2.14 質(zhì)粒提取
        2.2.15 質(zhì)粒線性化和回收
        2.2.16 畢赤酵母感受態(tài)的制備
        2.2.17 酵母工程菌篩選
        2.2.18 蛋白表達
        2.2.19 Western-Blot蛋白檢測
        2.2.20 點突變
        2.2.21 臺盼藍染色
        2.2.22 CRISP/Cas9基因編輯
            2.2.22.1 sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.22.2 pBluescript Ⅱ KS+重組載體的構(gòu)建
            2.2.22.3 使用CRISPR/Cas9敲除體系對PsGH7a進行基因敲除
3 結(jié)果與分析
    3.1 PsGH7a的序列分析
        3.1.1 信號肽預(yù)測
        3.1.2 構(gòu)建PsGH7a蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹
    3.2 鑒定大豆疫霉侵染初期PsGH7a的表達模式
    3.3 PsGH7a真核表達載體構(gòu)建
        3.3.1 目的基因克隆
        3.3.2 構(gòu)建pPIC9k::PsGH7a真核表達載體
    3.4 工程菌篩選驗證及蛋白表達
        3.4.1 工程菌篩選
        3.4.2 蛋白表達
        3.4.3 酶活性檢測
    3.5 蛋白激發(fā)子活性測定
    3.6 點突變
        3.6.1 PsGH7a的三維結(jié)構(gòu)模型
        3.6.2 酶活位點突變
        3.6.3 突變酶的表達
        3.6.4 突變酶活性測定
    3.7 蛋白和突變酶蛋白瞬時表達
    3.8 利用CRISPR/Cas9敲除PsGH7a
        3.8.1 設(shè)計sgRNA
        3.8.2 R2NW菌株中PsGH7a序列的上下游堿基序列的測序結(jié)果
        3.8.3 大豆疫霉PsGH7a敲除及轉(zhuǎn)化子驗證
        3.8.4 大豆疫霉P6497敲除轉(zhuǎn)化子的致病性檢測
            3.8.4.1 大豆疫霉P6497敲除轉(zhuǎn)化子對大豆下胚軸的致病性檢測
            3.8.4.2 大豆疫霉P6497敲除轉(zhuǎn)化子對大豆葉片的致病性檢測
4 結(jié)論與討論
    4.1 結(jié)論
    4.2 討論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]大豆種子分泌物對大豆疫霉發(fā)育行為的影響及其與品種抗病性關(guān)系[J]. 文景芝,徐瑩,張卓群,宋光梅,陳宇飛,趙鈺琦,高新穎,賈夢瑱,朱加楠.  東北農(nóng)業(yè)大學學報. 2018(10)
[2]植物次生細胞壁加厚過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[J]. 朱曉博,張貴粉,陳鵬.  植物生理學報. 2017(09)
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[4]中國大豆產(chǎn)業(yè)狀況和觀點思考[J]. 楊樹果,何秀榮.  中國農(nóng)村經(jīng)濟. 2014(04)
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[6]β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性與大豆對疫霉根腐病抗性的關(guān)系[J]. 左豫虎,康振生,楊傳平,芮海英,婁樹寶,劉惕若.  植物病理學報. 2009(06)
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博士論文
[1]CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的棉花GhCLA1和GhVP基因編輯的研究[D]. 陳修貴.華中農(nóng)業(yè)大學 2017
[2]疫霉菌一個新病原相關(guān)模式分子PsXEG1的鑒定和功能分析[D]. 馬振川.南京農(nóng)業(yè)大學 2015
[3]大豆對疫病的抗性評價、抗病基因挖掘及候選基因分析[D]. 張吉清.中國農(nóng)業(yè)科學院 2013

碩士論文
[1]山東省大豆疫霉的鑒定及生物學特性研究[D]. 代玉立.安徽農(nóng)業(yè)大學 2011



本文編號：3460448