西瓜枯萎病是一種重要的真菌病害,由尖孢鐮刀菌西瓜�；停‵usarium oxysporum f.sp.niveum）引起,在西瓜生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段發(fā)病。近些年來,因農(nóng)業(yè)種植面積不斷擴(kuò)大,輪種存在一定困難,導(dǎo)致西瓜枯萎病的危害日益加劇,對(duì)我國(guó)西甜瓜產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重影響。相比于其他植物病原真菌,目前關(guān)于西瓜枯萎病菌關(guān)鍵致病基因和作用機(jī)制的研究報(bào)道還較少。Tup1-Cyc8復(fù)合體是真核生物中高度保守的一種轉(zhuǎn)錄輔阻遏復(fù)合物,參與調(diào)控多種生物學(xué)過程。本文重點(diǎn)研究了輔阻遏蛋白基因Tup1在西瓜枯萎病菌致病性中的功能及其可能的作用機(jī)制。依靠PCR克隆技術(shù)和生物信息學(xué)分析,鑒定得到西瓜枯萎病菌中的Tup1基因,利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得敲除突變體ΔFonTup1和回補(bǔ)菌株ΔFonTup1-C;經(jīng)菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢表型分析、致病性測(cè)定、環(huán)境脅迫響應(yīng)能力測(cè)定和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析等研究,探究了FonTup1的生物學(xué)功能。主要研究結(jié)果如下:（1）經(jīng)過菌絲生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢能力、分生孢子萌發(fā)情況、病原菌致病性等方面的表型測(cè)定,相比于野生型菌株WT,ΔFonTup1突變體菌絲生長(zhǎng)受到明顯抑制,產(chǎn)孢量極低,且孢子形態(tài)異... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：99 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

FonTup1蛋白結(jié)構(gòu)分析及氨基酸同源序列比對(duì)Fig.3.1ProteinstructureandaminoacidalignmentsoftheFonTup1withitshomologsinotherfungi(A)PredictionofdomainsinFonTup1usingtheSMARTwebsite,anddrawtheprotein

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章結(jié)果與分析33圖3.4FonTup1基因敲除與回補(bǔ)的構(gòu)建及驗(yàn)證Fig.3.4ConstructionandidentificationofFonTup1genedeletionandcomplementarymutants(A)GenereplacementstrategyofFonTup1genedeletion.(B)Quantitativereal-timePCRanalysisofFonTup1geneinWTandtheknockoutmutantΔFonTup1#1,ΔFonTup1#2,ΔFonTup1#3.(C)SouthernblothybridizationanalysisofΔFonTup1#1,ΔFonTup1#2,ΔFonTup1#3usingafragmentofHPHasaprobe.(D)SouthernblothybridizationanalysisofWT,ΔFonTup1-C#12,ΔFonTup1-C#35andΔFonTup1-C#36usingafragmentofAmpasaprobe.

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章結(jié)果與分析343.2FonTup1亞細(xì)胞定位觀察構(gòu)建FonTup1基因回補(bǔ)及定位載體pYF11::FonTup1::GFP后，經(jīng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)入FonTup1敲除突變體內(nèi)，使用PCR驗(yàn)證確認(rèn)回補(bǔ)且表型恢復(fù)的回補(bǔ)菌株進(jìn)行FonTup1亞細(xì)胞定位觀察。共聚焦熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，F(xiàn)onTup1-GFP融合蛋白的綠色熒光信號(hào)定位于菌絲細(xì)胞核中（圖3.5），說明FonTup1可能作為轉(zhuǎn)錄輔抑制物在細(xì)胞核中發(fā)揮調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄的重要作用。圖3.5FonTup1亞細(xì)胞定位Fig.3.5SubcellularlocalizationofFonTup1FonTup1waslocalizedinthenucleusofthemyceliumofthecomplementedstrainwiththevectorpYF11::FonTup1::GFP.3.3西瓜枯萎病菌FonTup1的功能分析3.3.1FonTup1基因影響菌絲生長(zhǎng)將野生型菌株WT、FonTup1敲除突變體ΔFonTup1和回補(bǔ)突變體ΔFonTup1-C分別接種到PDA和MM培養(yǎng)基平板上，在26℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)6天后，觀察菌落生長(zhǎng)形態(tài)，十字交叉法測(cè)量菌落直徑大小并拍照記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示，不論在PDA還是MM培養(yǎng)基上，ΔFonTup1生長(zhǎng)速率都出現(xiàn)明顯下降，氣生菌絲減少（圖3.6A），菌落生長(zhǎng)直徑極顯著減�。≒-value＜0.01）（圖3.6B）。說明FonTup基因的缺失會(huì)嚴(yán)重抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]西瓜枯萎病菌蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）家族基因在致病性中的功能研究[D]. 曹仲曄.浙江大學(xué) 2017
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