本文關(guān)鍵詞：大興安嶺野生藍(lán)莓菌根真菌分離及定殖分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：與自然界中絕大多數(shù)植物相似,藍(lán)莓的根系中也存在著菌根真菌共生,這類菌根屬杜鵑花類菌根(Ericoid mycorrhizal, ERM)。菌根對藍(lán)莓植株的營養(yǎng)吸收、抗病性、抗逆性有很大的改善作用,其生物學(xué)促生功能極為重要。本研究對大興安嶺地區(qū)野生藍(lán)莓菌根真菌進(jìn)行了分離、鑒定,并利用原位PCR技術(shù)分析菌根真菌在藍(lán)莓植株根系的定殖情況。通過對大興安嶺地區(qū)野生藍(lán)莓菌根真菌主要類群及其定殖情況的了解,可以為優(yōu)良菌劑的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ),促進(jìn)大興安嶺地區(qū)野生藍(lán)莓引種栽培及繁育,同時也對菌根技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用具有重要的意義。結(jié)果如下：(1)以大興安嶺野生藍(lán)莓須根為實驗材料,利用馬丁—孟加拉紅(MA)培養(yǎng)基、MMN培養(yǎng)基分離了139株真菌,經(jīng)菌落形態(tài)結(jié)合分子生物學(xué)方法鑒定后分類結(jié)果如下：Oidiodendron、Crypyosporiopsis、Phialocephale、Lachnum、Yarrowia lipolytica、 Chaetomium globosum、Sordariomycetes sp.、Mucoromycotina sp.。(2)以質(zhì)粒pCAMBIA1300為骨架,將質(zhì)粒pCT74上的增強型GFP表達(dá)盒克隆到該質(zhì)粒的多克隆位點區(qū)(multiple cloning site, MCS),將質(zhì)粒pCT74上的真菌潮霉素抗性基因(hygromycin resisitant gene, HYG)表達(dá)盒克隆替換pCAMBIA1300原有的HYG表達(dá)盒,成功構(gòu)建了表達(dá)載體pXBtCEH-GFP。(3)利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT)成功使GFP基因在兩種藍(lán)莓內(nèi)生真菌Crypyosporiopsis ericae、Sordariomycetessp.的菌絲體內(nèi)表達(dá),通過熒光顯微鏡成功觀察到了熒光菌絲形態(tài),轉(zhuǎn)化子經(jīng)五代培養(yǎng)后熒光活性穩(wěn)定,通過PCR成功從轉(zhuǎn)化子基因組中得到GFP標(biāo)記片段。(4)以經(jīng)菌根真菌回接處理的藍(lán)莓組培無菌苗為實驗材料,制作根系的橫切與縱切冰凍切片,以ITS1/ITS4引物,以菌根真菌18S核糖體rDNA為模板,成功合成地高辛標(biāo)記的特異性DNA探針,通過原位PCR方法對真菌在藍(lán)莓根部的定殖做出初步分析。結(jié)果顯示,供試菌根真菌均有效的在藍(lán)莓根系內(nèi)定殖,定殖分布主要集中于根系的表皮和靠近表皮的皮層薄壁細(xì)胞間隙中,菌根真菌菌絲在根表有多個侵入點,表皮部位的定殖數(shù)量大于皮層中的數(shù)量。
【關(guān)鍵詞】：菌根真菌 綠色熒光蛋白 原位PCR 定殖
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S663.9;Q93
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 1 緒論9-15
• 1.1 引言9
• 1.2 藍(lán)莓9
• 1.3 植物菌根真菌的研究概況9-12
• 1.3.1 菌根9-10
• 1.3.2 菌根的分類及特征10
• 1.3.3 菌根的生物學(xué)作用10-11
• 1.3.4 菌根真菌及其物種多樣性11
• 1.3.5 菌根真菌的定殖11-12
• 1.3.6 影響菌根真菌的定殖的因素12
• 1.4 綠色熒光蛋白在真菌中的應(yīng)用研究12-13
• 1.4.1 綠色熒光蛋白12
• 1.4.2 綠色熒光蛋白作為標(biāo)記物的優(yōu)點12-13
• 1.4.3 GFP標(biāo)記微生物在植物體內(nèi)定殖的研究13
• 1.5 地高辛標(biāo)記原位雜交的原理及應(yīng)用13-14
• 1.5.1 地高辛標(biāo)記原位雜交的原理13
• 1.5.2 地高辛標(biāo)記原位雜交的應(yīng)用13-14
• 1.6 本研究的目的意義14-15
• 2 大興安嶺藍(lán)莓菌根真菌分離鑒定15-24
• 2.1 實驗材料15-16
• 2.1.1 藍(lán)莓菌根材料及采集地情況15
• 2.1.2 培養(yǎng)基15
• 2.1.3 其他試劑15-16
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備16
• 2.2 實驗方法16-18
• 2.2.1 菌根真菌的分離16
• 2.2.2 菌根真菌初步分類16-17
• 2.2.3 CTAB法提取菌根真菌基因組DNA17
• 2.2.4 PCR獲得菌根真菌基因組ITS段17-18
• 2.2.5 PCR產(chǎn)物的測序及序列分析18
• 2.3 結(jié)果與分析18-22
• 2.3.1 藍(lán)莓菌根真菌的分離18-19
• 2.3.2 菌根真菌的分子生物學(xué)鑒定19-22
• 2.4 討論22-23
• 2.5 本章小結(jié)23-24
• 3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)菌根真菌GFP標(biāo)記遺傳轉(zhuǎn)化24-39
• 3.1 實驗材料24-25
• 3.1.1 菌株24
• 3.1.2 質(zhì)粒24-25
• 3.2 儀器和試劑25-27
• 3.2.1 主要儀器25
• 3.2.2 試劑和培養(yǎng)基25-27
• 3.3 方法27-32
• 3.3.1 GFP表達(dá)盒的擴增27
• 3.3.2 GFP表達(dá)盒的克隆鑒定27-28
• 3.3.3 質(zhì)粒pCAMBIA1300的雙酶切28
• 3.3.4 重組質(zhì)粒pCEH-GFP的獲得與酶切鑒定28
• 3.3.5 HYG表達(dá)盒的酶切與測序鑒定28-29
• 3.3.6 表達(dá)載體pXBtCEH-GFP的構(gòu)建29-30
• 3.3.7 菌根真菌潮霉素抗性的檢測30
• 3.3.8 農(nóng)桿菌的電擊轉(zhuǎn)化30-31
• 3.3.9 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化31-32
• 3.4 結(jié)果與分析32-38
• 3.4.1 GFP表達(dá)原件的擴增32
• 3.4.2 pEASY-GFP的構(gòu)建及驗證32-33
• 3.4.3 pCEH-GFP的構(gòu)建及驗證33
• 3.4.4 HYG表達(dá)盒的酶切及測序驗證33-34
• 3.4.5 pXBtCEH-GFP的構(gòu)建及驗證34
• 3.4.6 hygB對菌根真菌生長的影響34-35
• 3.4.7 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子驗證35
• 3.4.8 菌根真菌轉(zhuǎn)化子獲得及菌絲熒光觀察35
• 3.4.9 菌根真菌轉(zhuǎn)化子驗證35-38
• 3.5 討論38
• 3.6 本章小結(jié)38-39
• 4 藍(lán)莓菌根真菌定殖情況初探39-47
• 4.1 材料和儀器試劑39
• 4.1.1 實驗材料39
• 4.1.2 實驗試劑39
• 4.2 實驗方法39-42
• 4.2.1 菌根真菌侵染藍(lán)莓無菌組培苗39-40
• 4.2.2 PCR法制備地高辛標(biāo)記探針40
• 4.2.3 斑點雜交驗證探針有效性40-41
• 4.2.4 藍(lán)莓菌根冰凍切片的制作41
• 4.2.5 冰凍切片的固定41
• 4.2.6 冰凍切片的消化41
• 4.2.7 原位PCR放大信號41-42
• 4.2.8 雜交42
• 4.3 結(jié)果與分析42-46
• 4.3.1 探針制備42
• 4.3.2 斑點雜交驗證探針有效性42-43
• 4.3.3 藍(lán)莓須根組織冰凍切片的雜交結(jié)果43-46
• 4.4 討論46
• 4.5 本章小結(jié)46-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文52-53
• 致謝53-54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：342175