本文關鍵詞：龍眼胚性愈傷組織AGO基因克隆與表達分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：龍眼(Dimocarpus longan Lour.),屬于無患子科(Sapindaceae)龍眼屬(Dimocarpus Lour.)常綠木本植物,龍眼胚胎發(fā)育的研究對于龍眼的生產(chǎn)具有重要的意義。植物體胚發(fā)育過程是一個復雜的過程,存在著許多代謝途徑和基因調(diào)控網(wǎng)絡,miRNA作為重要的調(diào)控因子植物體胚發(fā)生過程中一定存在著巨大的作用,與miRNA相互作用的AGO蛋白在龍眼體胚發(fā)生過程中也具有重要的作用。本研究擬通過對AGO家族基因進行克隆,以及熒光定量PCR技術對龍眼體胚發(fā)生不同階段以及四季密龍眼不同組織的中AGO基因的表達量進行分析,同時對其亞細胞定位進行研究,為揭示龍眼miRNA調(diào)控分子機制提供新的線索,并為調(diào)控龍眼等木本植物的胚胎發(fā)育提供理論依據(jù)。1龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因cDNA全長克隆通過對龍眼胚性愈傷組織的轉錄組分析和GeneBank中的比對,龍眼胚性愈傷組織中含有5種AGO蛋白,分別為AGO1、AGO2、AGO4、AGO5、AGO6,其中AG04基因的表達量極低。在此基礎上,利用RT-PCR和RACE技術,對AGO1、AGO2、AGO5、AGO6進一步克隆,最終獲得它們的cDNA全長序列：AGO1基因cDNA全長為3529 bp,開放閱讀框為3183 bp,編碼1061個氨基酸,命名為DlAGO1, GeneBank登錄號為KM001869; AGO2基因全長為3128 bp,5端UTR長度為73 bp,3端UTR長度為121 bp,開放閱讀框為2934bp(含終止子),編碼976個氨基酸,命名為DlAG02,登錄號為KM001870; AGO5基因的全長為3203 bp,開放閱讀框為2919 bp,編碼972個氨基酸,命名為DlAG05,登錄號為KM001871；龍眼胚性愈傷組織AG06基因cDNA的全長序列3168 bp,開放閱讀框(ORF)長為2700 bp,編碼900個氨基酸,命名為DlAGO6,登錄號為KF819529。2龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的生物信息學分析在上述基礎上,利用生物信息學對龍眼胚性愈傷組織AGO基因家族的基因進行基本理化性質(zhì)、磷酸化位點、蛋白質(zhì)保守結構域等進行分析。對龍眼胚性愈傷組織中AGO1、AGO2、AGO5和AG06基因編碼的氨基酸保守結構域分析結果顯示,DLAGO2 PIWI區(qū)域含有DDD結構,DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6含有DDH結構,由此推測龍眼胚性愈傷組織的AGO1、AGO2、AGO5、AGO6蛋白可能具有切割mRNA功能,參與轉錄后水平基因沉默。磷酸化位點的預測結果顯示,DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6蛋白絲氨酸磷酸化位點較多并N、C兩端分布密集,中間部分分布均勻,AGO蛋白的PIWI結構域具有RNA內(nèi)切酶活性,而該蛋白豐富的絲氨酸磷酸化位點,可能為增加該蛋白與小RNA結合后的轉錄后表達調(diào)控作用。DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6與擬南芥、水稻、葡萄AGO蛋白家族系統(tǒng)進化樹分析,發(fā)現(xiàn)龍眼胚性愈傷組織的AGO蛋白可能分為四個分支,并且DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6分別屬于龍眼胚性愈傷組織AGO蛋白的四個分支。3龍眼體胚發(fā)生過程以及龍眼不同組織器官中AGO1、AGO2、 AGO5和AGO6基因家族的表達定量分析用實時熒光定量技術對AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因在龍眼體胚發(fā)生過程中以及不同組織器官中進行相對定量表達分析。龍眼不同胚性階段的表達情況：在龍眼體胚發(fā)生過程早期,隨著體胚發(fā)生過程的推進,AGO1基因的表達量逐漸升高,在子葉時期的表達量有所降低,整體來看在非胚性階段的時候表達量是最高的；AGO2基因在龍眼的不同胚性階段的表達量具有差異,從整體趨勢來說,相對表達量的趨勢呈M型,在愈傷組織和球形胚時期的表達量是M型的兩個頂點,在非胚性階段、不完全緊實結構以及子葉胚時期表達量相對較低；AGO5基因在龍眼體胚的不同階段的表達具有顯著的差異,整體的呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,隨著體胚發(fā)生過程的推進,AGO5基因的表達逐漸降低,非胚性階段的表達量高于其它胚性階段；AGO6基因在龍眼體胚的不同階段的表達具有顯著的差異,整體的呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,隨著體胚發(fā)生過程的推進,AGO6基因的表達逐漸降低,但非胚性愈傷組織中的表達量相對低很多。龍眼不同組織部位的表達情況：AGO基因在龍眼不同組織部位中的表達具有差異顯著,其中AGO1基因在葉、花蕾、小果、大果、果皮以及種子中的表達量相對較低,在果肉中的相對表達量最高,可能與果肉的形成有關,另外在成花和根中的相對表達量同樣較高的,因此AGO1基因可能與花和根的發(fā)育相關miRNA具有相互作用關系；AGO2基因在根、葉、花蕾、成花、小果、大果、果肉、種子的表達量相對較低,在果皮內(nèi)的含量很高,推測AGO2基因與果皮的發(fā)育有關的miRNA具有相互作用。AGO5基因果皮中的表達量顯著高于其他組織部位,這個與AGO2基因相似,可能與AGO2基因有相互作用關系；AGO5基因在小果中的表達量極低,在大果中表達量也不高,卻在果皮中表達量高,推測可能在果實成熟后期的果皮發(fā)育過程中具有重要作用；AGO6基因成花與果肉的表達最高,在葉、大果、果皮的表達量相對較低,在根和花蕾相對表達量較高,小果和種子的相對表達量高于葉等的組織部位。4龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的亞細胞定位分析本研究過程中構建了龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6蛋白的亞細胞定位載體,采用了農(nóng)桿菌瞬時表達技術,于洋蔥表皮細胞中觀察AGO1、AGO2、AGO5和AGO6亞細胞定位熒光信號,結果顯示,AGO1主要在細胞核和微體中,AGO2主要集中于細胞核和細胞質(zhì)中,AGO5和AGO6主要集中于細胞核和細胞膜上。龍眼胚性愈傷組織AGO蛋白都定位于細胞核中,細胞核是生物體遺傳物質(zhì)以及核糖體合成的主要場所,對于細胞周期以及細胞衰老都具有重要功能,AGO蛋白的亞細胞定位的研究,有助于進一步探究基因功能。綜上所述,通過龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的序列和生物信息學分析,可以發(fā)現(xiàn)龍眼胚性愈傷組織AGO基因家族序列保守性較強,是一類保守的堿性蛋白,且龍眼AGO蛋白可以分為與水稻類似的四個分支。AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因在龍眼體胚發(fā)生過程中的差異表達,推測可能與細胞分裂速率有關,并在四季蜜不同組織中的差異表達,推測其可能參與特定器官的形態(tài)建成。亞細胞定位顯示AGO1、AGO2、AGO5和AGO6均定位于細胞核中。細胞核是生物體遺傳物質(zhì)以及核糖體合成的主要場所,對于細胞周期以及細胞衰老都具有重要功能,AGO蛋白的克隆、生物信息學分析、表達分析及亞細胞定位的研究,有助于進一步探究該基因的功能。
【關鍵詞】：龍眼 體胚發(fā)生 AGO 基因克隆 定量PCR 亞細胞定位
【學位授予單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S667.2
【目錄】：

• 縮寫詞9-10
• 摘要10-13
• Abstract13-17
• 第一章 引言17-27
• 1 植物體胚發(fā)生研究進展18-19
• 2 植物miRNA研究進展19-21
• 2.1 植物miRNA起源19-20
• 2.2 植物miRNA生物合成過程20
• 2.3 植物miRNA的調(diào)控作用機制20-21
• 2.4 植物miRNA的鑒定21
• 3 植物AGO蛋白的研究進展21-24
• 3.1 AGO蛋白的分類22
• 3.2 AGO蛋白的功能22-23
• 3.3 AGO蛋白的功能結構域23-24
• 3.4 AGO蛋白與miRNA結合的影響因素24
• 4 龍眼體胚發(fā)生的分子生物學研究進展24-25
• 5 本研究的意義及主要研究內(nèi)容25-27
• 5.1 本研究的意義25-26
• 5.2 本研究的主要內(nèi)容26-27
• 第二章 龍眼胚性愈傷組織AGO家族基因cDNA全長克隆27-49
• 1 材料與方法28-30
• 1.1 供試材料28
• 1.2 方法28-30
• 1.2.1 總RNA提取及cDNA的合成28
• 1.2.2 龍眼胚性愈傷組織AGO基因轉錄組分析28
• 1.2.3 引物設計28
• 1.2.4 目的片段擴增28-30
• 1.2.5 目的片段回收、TA克隆和測序30
• 1.2.6 序列拼接30
• 2 結果與分析30-47
• 2.1 龍眼胚性愈傷組織基因轉錄組數(shù)據(jù)分析30
• 2.2 龍眼胚性愈傷組織jca?基因cDNA全長序列的克隆30-35
• 2.3 龍眼胚性愈傷組織AGO2基因cDNA全長序列的克隆35-39
• 2.4 龍眼胚性愈傷組織AGO5基因cDNA全長序列的克隆39-43
• 2.5 龍眼胚性愈傷組織AGO6基因cDNA全長序列的克隆43-47
• 3 討論47-49
• 3.1 龍眼胚性愈傷組織AGO基因是保守性蛋白47
• 3.2 龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5、AGO6基因克隆意義47-49
• 第三章 龍眼胚性愈傷組織AGO家族基因的生物信息學分析49-72
• 1 材料和方法49
• 1.1 材料49
• 1.2 方法49
• 2 結果與分析49-70
• 2.1 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析49-51
• 2.2 蛋白的信號肽及亞細胞定位預測51-53
• 2.3 蛋白質(zhì)跨膜結構預測53-55
• 2.4 蛋白質(zhì)磷酸化結構預測55-58
• 2.5 蛋白卷曲螺旋結構預測58-59
• 2.6 蛋白質(zhì)結構特征分析59
• 2.7 蛋白質(zhì)二級結構分析59-66
• 2.8 蛋白質(zhì)的三級結構分析66-68
• 2.9 龍眼胚性愈傷組織AGO蛋白中AGO1、AGO2、AGO5以及AGO6的系統(tǒng)進化樹的構建68-70
• 3 討論70-72
• 3.1 龍眼胚性愈傷組織DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5、DlAGO6蛋白能具有切割mRNA功能,參與轉錄后水平基因沉默70-71
• 3.2 龍眼胚性愈傷組織DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5、DlAGO6絲氨酸磷酸化位點含量豐富,推測轉錄調(diào)控表達作用相關71
• 3.3 龍眼胚性愈傷組織DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5、DlAGO6進化樹分析,推測龍眼胚性愈傷組織AGO蛋白分為四個分支71-72
• 第四章 龍眼體胚發(fā)生過程以及龍眼不同組織器官中AGO基因家族的表達定量分析72-82
• 1 材料與試劑72-74
• 1.1 材料72
• 1.2 主要試劑和儀器72
• 1.3 方法72-74
• 1.3.1 龍眼體胚發(fā)生不同階段材料總RNA提取及cDNA合成72-73
• 1.3.2 引物設計73
• 1.3.3 實時熒光定量PCR73-74
• 1.3.4 標準曲線的制定74
• 2 結果與分析74-79
• 2.1 龍眼AGO1基因的差異表達分析74-76
• 2.1.1 龍眼體胚發(fā)生過程中AGO1基因的差異表達74-75
• 2.1.2 龍眼不同組織部位AGO1基因的差異表達75-76
• 2.2 龍眼AGO2基因的差異表達分析76-77
• 2.2.1 龍眼體胚發(fā)生過程中AGO2基因的差異表達76
• 2.2.2 龍眼不同組織部位AGO2基因的差異表達76-77
• 2.3 龍眼AGO5基因的差異表達分析77-78
• 2.3.1 龍眼體胚發(fā)生過程中AGO5基因的差異表達77-78
• 2.3.2 龍眼不同組織部位AGO5基因的差異表達78
• 2.4 龍眼AGO6基因的差異表達分析78-79
• 2.4.1 龍眼體胚發(fā)生過程中AGO6基因的差異表達78-79
• 2.4.2 龍眼不同組織部位AGO6基因的差異表達79
• 3 討論79-82
• 3.1 龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5、AGO6在龍眼體胚發(fā)生過程中的差異表達,推測可能與細胞分裂速率有關79-80
• 3.2 AGO1、AGO2、AGO5、AGO6在四季蜜不同組織中的差異表達,可能參與特定器官的形態(tài)建成80-82
• 第五章 龍眼AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的亞細胞定位分析82-89
• 1 材料與試劑82
• 1.1 菌株與載體82
• 1.2 受體材料82
• 1.3 生化試劑82
• 1.4 儀器設備82
• 2 實驗方法82-85
• 2.1 總RNA的提取以及cDNA的合成82-83
• 2.2 基因序列分析83
• 2.3 引物的設計與合成83
• 2.4 候選基因的PCR擴增83-84
• 2.5 載體酶切84
• 2.6 重組質(zhì)粒并鑒定84
• 2.7 重組質(zhì)粒轉化農(nóng)桿菌84-85
• 2.8 瞬時表達載體轉化洋蔥表皮以及顯微觀察85
• 3 結果與分析85-88
• 3.1 AGO蛋白信號肽序列分析以及核定位信號分析85-86
• 3.2 龍眼AGO1、AGO2、AGO5、AGO6基因亞細胞定位載體的構建86-87
• 3.3 龍眼愈傷組織cDNAAGO1、AGO2、AGO5、AGO6基因的亞細胞定位共聚焦觀察分析87-88
• 4 討論88-89
• 第六章 小結89-92
• 1 龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因cDNA全長克隆89-90
• 2 龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的生物信息學分析90
• 3 龍眼體胚發(fā)生過程以及龍眼不同組織器官中AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因家族的表達定量分析90-91
• 4 龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因家族的亞細胞定位分析91-92
• 參考文獻92-100
• 附錄 GenBank上登錄的龍眼愈傷組字AGO基因家族的序列信息100-112
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文、參加學術會議與獲獎情況112-113
• 致謝113

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊曼曼;龍眼胚性愈傷組織AGO基因克隆與表達分析[D];福建農(nóng)林大學;2015年

  本文關鍵詞：龍眼胚性愈傷組織AGO基因克隆與表達分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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