流感的爆發(fā)嚴(yán)重威脅人類的健康和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,現(xiàn)代流感疫苗的生產(chǎn)更趨向基于無血清懸浮細(xì)胞的工藝。MDCK細(xì)胞系是公認(rèn)為最適合甲、乙型流感病毒疫苗生產(chǎn)的三大細(xì)胞系之一,但該細(xì)胞固有貼壁依賴性,為了避免細(xì)胞懸浮馴化過程中由于傳代數(shù)目過多,導(dǎo)致用于大規(guī)模疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞活性和增值效率降低,結(jié)團(tuán)率升高這一問題,利用基因工程手段,有針對(duì)性地改造細(xì)胞表面粘附分子,抑制細(xì)胞的粘附性狀,構(gòu)建MDCK懸浮細(xì)胞系,將更符合現(xiàn)代疫苗生產(chǎn)需求。目前有關(guān)MDCK細(xì)胞上發(fā)揮粘附功能的有效蛋白及其粘附機(jī)制的研究少有報(bào)道,所以找出MDCK細(xì)胞表面的主要粘附蛋白并對(duì)其編碼基因的表達(dá)進(jìn)行抑制或敲除是解決問題的關(guān)鍵。本研究通過iTRAQ（Isobaric tag for relative and absolute quantitation）定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù),將本實(shí)驗(yàn)室馴化獲得的MDCK懸浮細(xì)胞與相同來源的MDCK貼壁細(xì)胞進(jìn)行差異蛋白分析,篩選MDCK細(xì)胞上可能與粘附相關(guān)的蛋白,選擇了其中經(jīng)典的粘附分子E-鈣粘蛋白（E-Cadherin,CDH1）,E-鈣粘蛋白的編碼基因?yàn)镃DH1基因,通過RNA干擾技術(shù)構(gòu)建CDH1低表達(dá)的... 

【文章來源】：西北民族大學(xué)甘肅省

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

甲型，乙型，丙型流感病毒結(jié)構(gòu)示意圖[42]

19圖2.1MDCKADH和MDCKSUS細(xì)胞差異蛋白的火山分析圖和聚類分析圖A.火山圖代表MDCKADH與MDCKSUS細(xì)胞統(tǒng)計(jì)分析中蛋白質(zhì)水平的差異顯著性和差異倍數(shù)，綠點(diǎn)是差異顯著的蛋白質(zhì)B.熱圖代表MDCKADH與MDCKSUS細(xì)胞統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中差異顯著的蛋白質(zhì)，以MDCKADH細(xì)胞為對(duì)照，MDCKSUS細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)差異倍數(shù)以顏色區(qū)分，藍(lán)色代表表達(dá)量下調(diào)的蛋白，紅色代表表達(dá)量上調(diào)的蛋白Fig.2.1MDCKADHandMDCKSUScellsdifferentialproteinvolcanoanalysisdiagramandclusteranalysisdiagramA.ThevolcanographrepresentsthedifferenceandmultipleoftheproteinlevelinthestatisticalanalysisofMDCKADHandMDCKSUScells.ThegreendotistheproteinwithsignificantdifferenceB.HeatmaprepresentsproteinswithsignificantdifferencesinthestatisticalanalysisofMDCKADHandMDCKSUScells.MDCKADHcellsisacontrol.ThedifferenceinMDCKSUScellsproteinexpressioniscolor-coded.Bluerepresentsproteinswithdown-regulatedexpressionandredrepresentsproteinswithup-regulatedexpression3.2GeneOntology（GO）富集分析GeneOntology（GO）是一個(gè)擁有持續(xù)更新的標(biāo)準(zhǔn)化詞匯表來對(duì)基因功能進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分類的系統(tǒng)，該系統(tǒng)從三個(gè)方面對(duì)生物體中的基因及其產(chǎn)物的屬性進(jìn)行描述：分子功能（MolecularFunction）、細(xì)胞組分（CellularComponent）和生物過程（BiologicalProcess）。通過Fisher精確檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)GO注釋的顯著性富集分析，本實(shí)驗(yàn)GO富集分析中，總共有1250個(gè)GO注釋，檢測(cè)了643個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。每組中排名靠前的10個(gè)GO注釋，由它們之間的差異P值確定（如圖2.2）。以MDCKADH細(xì)胞為對(duì)照，通過馴化獲得的MDCKSUS細(xì)胞在“生物過程”組中，鑒定出的許多蛋白質(zhì)都參與細(xì)胞代謝的過程，分析表明?

20理過程[149,150]，分析表明，馴化獲得的MDCKSUS細(xì)胞的外泌體蛋白表達(dá)發(fā)生了顯著變化，這些蛋白質(zhì)表達(dá)的變化如何影響MDCK細(xì)胞的外泌體功能需要進(jìn)一步研究；在“分子功能”組中，發(fā)現(xiàn)許多差異蛋白質(zhì)與細(xì)胞催化和粘附功能相關(guān)，這暗示馴化獲得的MDCKSUS細(xì)胞除了粘附功能被抑制以外還有許多蛋白酶的表達(dá)也發(fā)生了變化。圖2.2MDCKADH和MDCKSUS細(xì)胞顯著性差異蛋白質(zhì)的GO富集分析根據(jù)生物學(xué)過程（藍(lán)色），細(xì)胞成分（紅色）和分子功能（黃色）將顯著性差異蛋白質(zhì)劃分為不同類別，圖中顯示的是各類別差異最顯著的前十個(gè)Fig.2.2AnalysisofGOenrichmentofsignificantlydifferentproteinsinMDCKADHandMDCKSUScellsProteinswithsignificantdifferencesaredividedintocategoriesbasedonbiologicalprocesses(blue),cellularcomposition(red)andmolecularfunction(yellow).Thechartshowsthetoptenmostsignificantdifferencesbycategory3.3粘附相關(guān)蛋白的篩選對(duì)MDCK細(xì)胞上可能發(fā)揮粘附功能的蛋白質(zhì)進(jìn)行篩眩首先使用GO富集分析，鑒定出了50種蛋白質(zhì)，它們與細(xì)胞粘附功能相關(guān)且在MDCKADH和MDCKSUS細(xì)胞上的蛋白表達(dá)量存在顯著性差異。其次篩選了位于細(xì)胞膜上或與細(xì)胞膜蛋白相結(jié)合的蛋白質(zhì)。最后由于正調(diào)控粘附功能的粘附分子在MDCKSUS細(xì)胞中表達(dá)量必定顯著降低，因此篩選了在MDCKADH細(xì)胞中表達(dá)量高，在MDCKSUS細(xì)胞中表達(dá)量低的蛋白質(zhì)。同時(shí)符合上述三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)共有12個(gè)（如表2.2）。其中，鈣粘附蛋白1（CDH1），橋粒芯蛋白3（DSG3）和上皮細(xì)胞粘附分子（EPCAM）已報(bào)道在其它細(xì)胞中起到典型的細(xì)胞粘附分子（CAM）


本文編號(hào)：3379969