發(fā)布時間：2017-04-30 15:04

  本文關鍵詞：FSTL3基因在綿羊常年發(fā)情中的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本實驗旨在從分子水平和細胞水平上探究FSTL3在綿羊常年發(fā)情中的功能,來揭示FSTL3與綿羊繁殖季節(jié)性間的關系,為進一步闡明綿羊常年發(fā)情的分子機理提供理論基礎。通過驗證不同生理狀態(tài)下小尾寒羊和灘羊卵巢中FSTL3基因的表達差異情況,以常年發(fā)情的小尾寒羊卵巢顆粒細胞為研究對象,建立穩(wěn)定的綿羊卵巢顆粒細胞的原代培養(yǎng)體系,在細胞水平上對FSTL3基因進行RNA干擾,利用Real-time PCR、Western-Blot以及免疫熒光技術分別在RNA水平和蛋白水平上驗證FSTL3蛋白表達的抑制情況,并通過放射性免疫分析檢測FSTL3基因被干擾后顆粒細胞中雌二醇與孕酮濃度的變化,實驗結論如下：1.通過RT-PCR檢測處于不同生理狀態(tài)下的小尾寒羊和灘羊卵巢組織中FSTL3基因的表達量,發(fā)現(xiàn)在兩種綿羊的卵巢組織中,FSTL3基因的表達水平均隨著發(fā)情周期呈波動性表達：FSTL3基因的表達水平在發(fā)情間期達到頂峰,隨著發(fā)情周期逐漸下降,并在發(fā)情期降至最低。在秋季,小尾寒羊和灘羊發(fā)情期的FSTL3基因表達量沒有差異。在春季時,灘羊處于乏情期,FSTL3基因的表達相對穩(wěn)定,保持在一個較低的水平；而小尾寒羊FSTL3基因的表達水平依然成周期性變化,為了探究FSTL3基因是否影響小尾寒羊的常年發(fā)情啟動,我們在細胞水平上進一步研究。2.對原代培養(yǎng)的卵巢顆粒細胞進行FSHR免疫熒光染色,結果顯示原代培養(yǎng)的卵巢顆粒細胞純度高,FSHR陽性率達95%以上,可以直接進行后續(xù)實驗。3.用RNAi的方法對小尾寒羊卵巢顆粒細胞中FSTL3基因表達進行抑制,通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)FSTL3基因的3條siRNA的干擾效率分別為62.33%、49.27%、85.84%,其中SiRNA-3能有效地干擾卵巢顆粒細胞中FSTL3基因的表達。4.在蛋白水平上驗證RNAi的作用,Western-blot和細胞免疫熒光染色的結果表明,FSTL3干擾組的蛋白表達量極顯著降低(P0.01),說明FSTL3蛋白被有效抑制。5.對RNAi后48h的細胞培養(yǎng)基進行放射性免疫分析,結果顯示FSTL3基因的表達被抑制后,細胞培養(yǎng)基中的E2含量顯著增加(P0.05),P4的含量極顯著減少(P0.01),證實FSTL3基因對顆粒細胞分泌E2有一定負調控作用,對P4有正調控作用,進一步表明FSTL3基因可能對綿羊的季節(jié)性繁殖有一定調控作用。
【關鍵詞】：FSTL3 小尾寒羊 顆粒細胞 RNAi
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S826
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 1. 文獻綜述11-20
• 1.1 動物的季節(jié)性繁殖11-13
• 1.1.1 季節(jié)性繁殖的定義11
• 1.1.2 季節(jié)性繁殖的調控機理11-13
• 1.2 顆粒細胞的研究進展13-16
• 1.2.1 顆粒細胞的生物學作用13-15
• 1.2.2 影響顆粒細胞增殖與凋亡的因素15-16
• 1.3 FSTL3的研究進展16-18
• 1.3.1 FSTL3的結構16
• 1.3.2 FSTL3的生物學機制16-18
• 1.4 本實驗的研究內容和意義18-20
• 1.4.1 研究內容18
• 1.4.2 研究意義18-20
• 2. 材料和方法20-32
• 2.1 實驗材料20
• 2.2 試驗時間與地點20
• 2.3 主要試劑20-21
• 2.4 主要儀器設備21-22
• 2.5 試驗方法22-32
• 2.5.1 卵巢顆粒細胞原代培養(yǎng)22-23
• 2.5.2 siRNA的設計與合成23
• 2.5.3 RNAi23-24
• 2.5.4 細胞免疫熒光染色24
• 2.5.5 細胞總RNA和蛋白質提取24-26
• 2.5.5.1 RNA提取24-25
• 2.5.5.2 RNA濃度與質量檢測25
• 2.5.5.3 蛋白質提取25-26
• 2.5.5.4 蛋白質濃度測定26
• 2.5.6 反轉錄26-27
• 2.5.7 熒光實時定量檢測27-29
• 2.5.7.1 引物設計合成27-28
• 2.5.7.2 標準品的稀釋28
• 2.5.7.3 熒光實時定量28-29
• 2.5.8 Western-blot29-31
• 2.5.8.1 SDS-PAGE電泳29-30
• 2.5.8.2 轉膜30
• 2.5.8.3 免疫反應30
• 2.5.8.4 化學發(fā)光30-31
• 2.5.9 放射免疫分析31-32
• 3. 結果與分析32-47
• 3.1 標準曲線的構建32-35
• 3.2 FSTL3基因表達分析35-36
• 3.3 卵巢顆粒細胞原代培養(yǎng)結果36-38
• 3.3.1 顆粒細胞形態(tài)學觀察36-37
• 3.3.2 FSHR免疫熒光染色檢測37-38
• 3.4 RNAi實驗結果38-47
• 3.4.1 RNA濃度與質量檢測結果38-40
• 3.4.2 蛋白質濃度與質量檢測結果40-41
• 3.4.3 FSTL3基因的siRNA篩選結果41-43
• 3.4.4 FSTL3蛋白表達分析43-45
• 3.4.5 FSTL3對顆粒細胞激素分泌影響的檢測45-47
• 4. 討論47-52
• 4.1 小尾寒羊顆粒細胞原代培養(yǎng)的建立47-48
• 4.2 RNAi抑制FSTL3基因的表達48-50
• 4.3 FSTL3對常年發(fā)情的調控作用50
• 4.4 FSTL3對顆粒細胞激素分泌的影響50-52
• 5. 結論52-53
• 6. 參考文獻53-61
• 致謝61-62
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文62

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