菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）是我國十大傳統(tǒng)名花和世界四大鮮切花之一,其栽培面積和產(chǎn)量在各花卉中均居于前列。氮素營養(yǎng)水平通常會影響菊花的產(chǎn)量和品質(zhì)。硝態(tài)氮（NO3--N）是菊花吸收氮素的主要形式。根系吸收的NO3-經(jīng)過木質(zhì)部導(dǎo)管長途轉(zhuǎn)運后主要存儲在葉片液泡中,并能在氮源不足時將儲存在液泡中的N03-釋放出來供菊花再分配和再利用。因此,了解N03-在菊花葉片液泡中的儲存機制對培育氮高效利用率和氮饑餓耐受性高的菊花新品種至關(guān)重要。近年來的研究發(fā)現(xiàn)定位于液泡膜上的CLC家族的一些基因可能參與植物液泡N03-的存儲。但在菊花中關(guān)于這一方面的報道還比較少。本研究以菊花扦插生根苗‘神馬’為試材,外源N03-水培條件下篩選出液泡NO3-響應(yīng)基因CnCLCa并對其進行功能驗證。主要研究內(nèi)容及結(jié)果:1、外源NO3-能誘導(dǎo)菊花CmCLCa的表達(dá)用含有5 mM KN03的Hoagland營養(yǎng)液水培處理（對照為不含N元素的Hoagland營養(yǎng)液）后,分別在第0、1、4、8、12、16、20和24 h對液泡NO3-存儲相關(guān)基因CmCLCa-c、CmCLCg進行實時熒光定量... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

外源NO3-處理對菊花葉片液泡NO3-存儲相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文下同。Fig.3-1EffectsofexogenousNO3-treatmentontherelativeexpressionlevelsofvacuolarNO3-storage-relatedgenesCmCLCa-candCmCLCginchrysanthemumleavesA:CmCLCa;B:CmCLCb;C:CmCLCc;D:CmCLCg.Dataaremean±SE(n=3).DifferentlowercaselettersonbarsindicatestatisticallysignificantdifferencesinmeanvaluesatP<0.05.Thesameasfollows.3.1.2NO3-處理對菊花葉片液泡中NO3-含量的影響在本實驗中，我們還測定了外源NO3-（5mMNO3-）處理下菊花葉片液泡內(nèi)NO3-含量的變化（圖3-2）。實驗結(jié)果表明，隨著處理時間的延長，菊花葉片液泡NO3-含量不斷增加，并在處理第8h達(dá)到最大值為7.4umolNO3-/umolp-nitrophenol，之后雖有所下降但始終保持在較為穩(wěn)定的狀態(tài)且明顯高于對照。這一變化趨勢與外源NO3-處理下菊花CmCLCa基因相對表達(dá)量的變化趨勢一致（圖3-1A）。圖3-2外源NO3-處理對菊花葉片液泡NO3-含量的影響Fig.3-2EffectofexogenousNO3-treatmentonthevacuolarNO3-contentofchrysanthemumleaves3.2菊花CmCLCa基因的功能鑒定3.2.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菊花遺傳轉(zhuǎn)化前面的實驗我們發(fā)現(xiàn)外源NO3-能夠誘導(dǎo)菊花CmCLCa的表達(dá)，同時液泡中存儲的NO3-含量也顯著增加。我們猜測，液泡中存儲NO3-含量的增加是否與CmCLCa基因相對表達(dá)量升高有關(guān)？為了進一步探究CmCLCa基因與液泡中積累NO3-之間的關(guān)系，我們通過與擬南芥AtCLCa序列比對獲得了384bp的保守區(qū)域，然后用于在沉默構(gòu)建體中生成RNAi片段，并獲得了CmCLCa-RNAi轉(zhuǎn)基因菊花‘神馬’組培苗（圖3-3）。25

菊花CmCLCa基因的表達(dá)分析及功能驗證圖3-3CmCLCa-RNAi轉(zhuǎn)基因‘神馬’組培苗比例尺=1cm。Fig.3-3CmCLCa-RNAitransgenic‘Jinba’tissuecultureseedlingsScalebar:1cm.3.2.2CmCLCa-RNAi轉(zhuǎn)基因菊花的分子鑒定在菊花轉(zhuǎn)基因過程中，當(dāng)分化出的小苗長到約5cm時，取葉片進行分子水平檢測（圖3-4A，B）。半定量PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因系#1，#2，#3在384bp左右有單一且比較清晰明亮的條帶，#5有拖尾現(xiàn)象，#4無條帶。同時，定量PCR排除了轉(zhuǎn)基因系#1，#2，#3為假陽性菊花苗的可能。因此，我們選擇轉(zhuǎn)基因菊花系#1、#2、#3用于接下來的實驗。圖3-4B為其相對表達(dá)抑制情況：與WT相比，轉(zhuǎn)基因菊花系#1、#2、#3中CmCLCa的表達(dá)量分別下降了25.1%、32.4%、23.3%。圖3-4CmCLCa-RNAi轉(zhuǎn)基因菊花的分子檢測A：半定量PCR檢測；B：q-RTPCR檢測Fig.3-4ThemoleculardetectionofCmCLCa-RNAitransgenicchrysanthemumA:semi-quantitativePCRdetection;B:quantitativePCRdetection26

【參考文獻(xiàn)】：
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