自2010年鴨坦布蘇病毒病在我國首次爆發(fā)以來,該病給我國鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。該病主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋率驟降,并伴有高熱、食欲下降、運動障礙等臨床癥狀,嚴重時可導致鴨死亡。第一株坦布蘇病毒分離株（MM1775株）,是從馬來西亞地區(qū)的蚊子體內(nèi)分離到的。在隨后幾十年陸續(xù)從蚊子體內(nèi)分離到很多株坦布蘇病毒,但卻很少有動物感染該病毒的報道。到目前為止,早期坦布蘇病毒蚊體分離株在不同動物體內(nèi)的復制能力、對動物的致病性及在動物間的傳播能力等生物學特性尚不可知。了解坦布蘇病毒早期分離株與我國現(xiàn)在流行的鴨坦布蘇病毒株的生物學特性的差異,對研究坦布蘇病毒的致病機制具有重要意義。為了比較MM1775和FX2010這兩株病毒基因組序列的差異,本研究測定了MM1775完整的基因組序列。通過5’和3’RACE技術擴增得到MM1775基因組5’和3’末端的序列。利用RT-PCR擴增得到10段兩兩重疊的涵蓋MM1775全基因組的目的片段,序列拼接后得到了MM1775全基因組序列。與FX2010的全基因組序列相比,編碼蛋白（C、pr M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）依次有... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

’RACE（A）和3’RACE（B）電泳結果

圖 2.1 5’RACE（A）和 3’ RACE（B）電泳結果Fig. 2.1 ResμLts of 5’RACE（A） and 3’RACE（B）2.3.2 MM1775 基因組分片段擴增結果在得到 MM1775 基因組 5’末端和 3’末端序列后，以設計的 7 個特異性反轉錄引物混合后作為特異性反轉錄引物，以病毒 RNA 為模板，經(jīng) SuperScriptⅢ反轉錄酶將 RNA 反轉錄為 cDNA，以此 cDNA 為模板，進行 PCR 擴增、凝膠電泳（圖 2.2）、割膠回收等步驟，得到 10 段覆蓋全基因組的序列，經(jīng)拼接后得到 MM1775 全基因組序列。

中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第二章 坦布蘇病毒 MM1775 株全基因組序列測定2.3.3 MM1775 和 FX2010 基因組序列比較利用 5’和 3’RACE 技術得到 MM1775 基因組 5’和 3’末端序列，隨后參考 GenBank 中已經(jīng)發(fā)表的 MM1775 開放閱讀框序列設計 10 對 PCR 引物，擴增得到 10 段特異性片段，相鄰兩個片段之間有一部分重疊序列，通過對 10 段 PCR 產(chǎn)物的純化、測序，并通過 DNAstar 軟件中的 SegMan程序拼接得到 MM1775 的全基因序列。此序列的開放閱讀框與 GenBank 中已經(jīng)發(fā)表的 MM1775株開放閱讀框有五個核苷酸不同，分別為 521(C/T)，1398(C/A)，1948(C/T)，5890(C/T) 和 7499(G/A)（核苷酸在基因組中的位置（本研究所用 MM1775 的核苷酸/已發(fā)表的 MM1775 核苷酸））。MM1775 全基因組共包含 11001bp 核苷酸，5’非翻譯區(qū)由 94 個核苷酸組成，3’非翻譯區(qū)由 629 個核苷酸組成，其中含有一個大小為 10278bp 的開放閱讀框，編碼產(chǎn)生大小為 3425 個氨基酸的多聚蛋白，同黃病毒屬的其他病毒一樣，該多聚蛋白在相關蛋白酶的作用下裂解為 3 個結構蛋白(C，prM，E)和 7 個非結構蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B 和 NS5)。與 FX2010 的蛋白質氨基酸殘基相比，不同點分別有：5/12(4.2%)，4/167(2.4%)，16/501(3.2%)，21/352(6.0%)，16/227(7.5%)，4/131(3.1%)，8/619(1.3%)，4/126(3.2%)，5/254(2.0%) 和 18/905(2.0%)（表 2.4）。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]鴨坦布蘇病毒TaqMan熒光定量PCR方法的優(yōu)化[J]. 彭珊,閆麗萍,李國新,李雪松,滕巧泱,肖亞莉,何文興,李澤君.  中國預防獸醫(yī)學報. 2013(04)
[2]密碼子優(yōu)化對鴨坦布蘇病毒E基因DNA疫苗免疫應答的增強作用[J]. 徐大偉,李國新,李雪松,李云章,李澤君.  中國獸醫(yī)科學. 2012(05)
[3]鴨坦布蘇病毒E基因DNA疫苗構建及免疫原性的初步研究[J]. 徐大偉,李國新,李雪松,姬希文,李云章,李澤君.  中國預防獸醫(yī)學報. 2012(04)
[4]鴨坦布蘇病毒E蛋白的原核表達[J]. 姬希文,李雪松,邊延峰,李國新,顏丕熙,張七斤,李澤君.  中國動物傳染病學報. 2012(02)
[5]鴨坦布蘇病毒E蛋白中和性單克隆杭體的制備[J]. 姬希文,李雪松,李國新,肖亞莉,顏丕熙,徐大偉,范釗,張七斤,李澤君.  中國家禽. 2012(04)
[6]鴨坦布蘇病毒病病原的分離鑒定及生物學特性研究[J]. 李澤君.  中國家禽. 2011(17)
[7]鴨坦布蘇病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立[J]. 姬希文,閆麗萍,顏丕熙,李國新,張七斤,李澤君.  中國預防獸醫(yī)學報. 2011(08)
[8]應用套式RT-PCR快速檢測鴨坦布蘇病毒[J]. 顏丕熙,李國新,吳曉剛,閆麗萍,滕巧泱,李澤君.  中國動物傳染病學報. 2011(03)
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碩士論文
[1]鴨坦布蘇病毒E蛋白抗原性分析[D]. 余磊.中國農(nóng)業(yè)科學院 2014
[2]鴨坦布蘇病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立[D]. 石迎.山東農(nóng)業(yè)大學 2014
[3]鴨坦布蘇病毒弱毒株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立[D]. 吳曉剛.中國農(nóng)業(yè)科學院 2014
[4]鴨坦布蘇病毒在雞胚成纖維細胞上的傳代致弱研究[D]. 肖亞莉.中國農(nóng)業(yè)科學院 2013



本文編號：3352740