奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖中最常見(jiàn)、危害最為巨大的疾病之一,金黃色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要致病菌之一,其引發(fā)的乳房炎具有致病后難以治愈的特點(diǎn)。腸毒素是金黃色葡萄球菌重要的毒力因子,具有超抗原活性,與引起奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌的致病性密切相關(guān),多項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示,腸毒素seu基因在奶牛乳房炎樣本中檢出。基于seu基因的流行性,本研究從奶牛源金黃色葡萄球菌中克隆了seu基因、表達(dá)并純化了金黃色葡萄球菌腸毒素U蛋白（SEU）,建立了檢測(cè)SEU蛋白水平的ELISA方法以及探索了SEU對(duì)牛乳腺上皮細(xì)胞增殖和細(xì)胞炎性因子分泌的影響。主要研究?jī)?nèi)容如下:（1）克隆了seu基因。本研究分離了奶牛源金黃色葡萄球菌、提取了細(xì)菌基因組DNA,設(shè)計(jì)引物并克隆了金黃色葡萄球菌腸毒素U的特異性基因seu的基因片段并連接至pMD19-T克隆載體,通過(guò)生物信息學(xué)分析方法,對(duì)seu基因及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)了SEU蛋白的基本理化特性以及蛋白信號(hào)肽和跨膜區(qū)域。結(jié)果表明,成功獲得了長(zhǎng)度為786 bp的金黃色葡萄球菌seu克隆片段,分析得知SEU蛋白由261個(gè)氨基酸組成,相對(duì)分子量約為30.53 kDa,分子式為... 

【文章來(lái)源】：西南民族大學(xué)四川省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【圖文】：

PCR鑒定金黃色100bp100b

金黃色葡萄球菌腸毒素U的純化、檢測(cè)及其誘發(fā)乳腺上皮細(xì)胞炎癥的初探18(1)(2)圖2-2SEU蛋白跨膜區(qū)域及信號(hào)肽分析Figure.2-2SignalpeptideandtransmembraneregionpredictionofSEU2-2-(1)SEU跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析transmembrane：跨膜區(qū)；inside：胞內(nèi)區(qū)；outside胞外區(qū)2-2-(2)SEU蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)C-score：酶切位點(diǎn)分值；S-score：信號(hào)肽分值；Y-score：綜合參數(shù)分值2.4討論本研究對(duì)金黃色葡萄球菌腸毒素SEU的特異性基因seu及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了基本的序列、分子特征等生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)了SEU蛋白的基本物理及化學(xué)參數(shù)、氨基酸跨膜區(qū)域及信號(hào)肽成分等信息，了解到該蛋白的基本信息，并使用PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得了seu基因的克隆片段，將該基因片段連接至克隆載體pMD19-T并導(dǎo)入E.coliDH5α完成轉(zhuǎn)化擴(kuò)增，成功構(gòu)建了pMD19-T-seu重組克隆載體，為后續(xù)研究打下基矗2.5小結(jié)本研究從金黃色葡萄球菌株中使用PCR擴(kuò)增技術(shù)克隆了長(zhǎng)度為786bp的seu基因片段、構(gòu)建了pMD19-T-seu克隆載體，對(duì)金黃色葡萄球菌腸毒素SEU進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，得知SEU蛋白是由261個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量約為30.53kDa，總原子數(shù)目為4243，分子式為C1365H2095N355O415S13。理論等電點(diǎn)PI為6.66，總平均親水性為-0.675，表明其性質(zhì)是一個(gè)堿性親水的蛋白質(zhì)。體外半衰期為大于10h，不穩(wěn)定系數(shù)為33.97，表明該SEU是結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。在線分析工具預(yù)測(cè)氨基酸跨膜區(qū)域及信號(hào)肽成分得知，SEU蛋白不存在跨膜區(qū)，是一個(gè)膜外蛋白，第1~17個(gè)氨基酸為信號(hào)肽成分。

金黃色葡萄球菌腸毒素U的純化、檢測(cè)及其誘發(fā)乳腺上皮細(xì)胞炎癥的初探263.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.3.1seu原核表達(dá)載體pET-30a(+)-seu的構(gòu)建與鑒定將PCR擴(kuò)增得到的seu基因片段經(jīng)T載體克隆與雙酶切反應(yīng)連接至pET-30a(+)載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞后篩選得到單克隆，以單克隆落于無(wú)菌水后所得懸濁液作為DNA模版進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增seu基因，并對(duì)單克隆增菌后提取的重組載體進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，菌落PCR擴(kuò)增所得條帶與預(yù)期相符，見(jiàn)圖3-1。重組pET-30a(+)-seu載體經(jīng)序列測(cè)序后，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得知擴(kuò)增所得seu基因片段與登錄ID為AY205307.1的Staphylococcusaureusstrain383F菌株的enterotoxinSEU(seu)核苷酸序列中第127至912位處堿基相似率達(dá)99%，表明seu基因原核表達(dá)載體pET-30a(+)-seu構(gòu)建成功。圖3-1菌落PCR鑒定seuFigure.3-1IdentificationforseubycolonyPCRM：DNAMarkerDL2000；1：陰性對(duì)照；2~5：pET-30a(+)-seu質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單菌落；箭頭標(biāo)識(shí)為seu基因目的條帶所在位置3.3.2重組蛋白原核表達(dá)3.3.2.1選擇高原核表達(dá)工程菌株將鑒定正確的重組載體質(zhì)粒pET-30a(+)-seu轉(zhuǎn)化至表達(dá)工程菌BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞后使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)所收集菌體裂解后所得沉淀及上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，圖3-2結(jié)果表明重組蛋白質(zhì)主要存在于上清液中，其分子量大小與預(yù)期相符，說(shuō)明目的蛋白SEU以可溶性形式成功表達(dá)。750bp500bp2000bp1000bp250bp100bp

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3339880