ZmFBL41互作蛋白ZmFAH在玉米紋枯病抗性中的功能驗證
發(fā)布時間：2021-08-13 02:23
本研究前期通過對318份玉米自交系的全基因組關(guān)聯(lián)分析克隆到一個紋枯病抗性基因ZmFBL41。在玉米自交系B73中,ZmFBL41編碼F-box蛋白,負(fù)調(diào)控玉米對紋枯病的抗性。ZmFBL41蛋白是E3泛素連接酶復(fù)合體（Skpl-Cullins-F-box,SCF）的重要組成部分,在感病型玉米B73中介導(dǎo)SCF復(fù)合體對肉桂醇脫氫酶ZmCAD的降解,使得木質(zhì)素合成受阻,積累量下降。而在抗病玉米自交系如Chang7-2中,ZmFBL41Chang7-2存在兩個關(guān)鍵氨基酸的替換,使其喪失了與底物ZmCAD的特異性結(jié)合,從而無法介導(dǎo)ZmCAD的降解,積累木質(zhì)素而抗病。同時,將ZmFBL41B73的LRR作為誘餌蛋白進(jìn)行SCFZmFBL41底物蛋白的篩選過程中,除了上述鑒定的ZmCAD之外,還篩選到其他候選互作蛋白,如富馬�；阴Ｒ宜崴饷福╖mFAH）。為更全面解析ZmFBL41介導(dǎo)的紋枯病抗性機(jī)制,本研究對其蛋白互作進(jìn)行了驗證,對ZmFAH在抗紋枯病過程中的降解和生物學(xué)功能開展了相關(guān)研究,取得以下主要研究結(jié)果。1.利用酵母雙雜交技...
【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省
【文章頁數(shù)】：55 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
候選基因CDS區(qū)擴(kuò)增Fig.1CDSamplificationofcandidategenes
ZmFBL41互作蛋白ZmFAH在玉米紋枯病抗性中的功能驗證26ZmFBL41B73LRR誘餌載體同時導(dǎo)入Y2HGold菌株中，以pGADT7載體與pGBKT7::ZmFBL41B73LRR同時轉(zhuǎn)化Y2HGold菌株作為陰性對照。所有轉(zhuǎn)化酵母涂布到SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，將陽性酵母菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，依次按照濃度梯度對應(yīng)加到SD/-Trp-Leu和SD/-Ade-His-Trp-Leu培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)果（圖2）顯示：在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上所有酵母菌株都能夠正常生長，而在SD/-Ade-His-Trp-Leu培養(yǎng)基上只有同時轉(zhuǎn)有pGBKT7::ZmFBL41B73LRR和pGADT7::ZmFAH載體的酵母菌株正常生長，而轉(zhuǎn)有其他三個蛋白的酵母菌株不能生長，說明ZmFAH蛋白能夠與ZmFBL41的LRR結(jié)構(gòu)域互作，因此將ZmFAH蛋白作為候選蛋白進(jìn)行深入研究。圖2酵母雙雜交驗證ZmFBL41蛋白LRR結(jié)構(gòu)域與候選蛋白的互作Fig.2ValidationoftheinteractionbetweentheLRRdomainofZmFBL41andeachcandidateproteinsusingyeasttwo-hybridization3.3免疫共沉淀實驗驗證ZmFBL41蛋白LRR結(jié)構(gòu)域與ZmFAH蛋白互作首先將ZmFBL41B73LRR構(gòu)建到pCXUN-Myc載體中，將ZmFAH構(gòu)建到pCXUN-HA載體中，分別導(dǎo)入到農(nóng)桿菌GV3101，利用載體引物Ubi-F和片段自身引物通過PCR對農(nóng)桿菌進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)（圖3A左ZmFAH1365bp，右1465bp圖3B左ZmFBL41B73LRR323bp，右423bp）。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時表達(dá)技術(shù)在本生煙葉片中表達(dá)ZmFBL41蛋白的LRR結(jié)構(gòu)域和ZmFAH蛋白，提取總蛋白后進(jìn)行免疫共沉淀并通過western
山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文27blotting進(jìn)行檢測。結(jié)果表明（圖3C），在Input樣品中，對照組和實驗組均能夠檢測到相應(yīng)的蛋白條帶，說明蛋白均被正常表達(dá)；經(jīng)HA磁珠的IP操作后，實驗組檢測到ZmFAH-HA蛋白，也檢測到了ZmFBL41B73LRR-Myc蛋白；而對照組僅檢測到ZmFBL41B73LRR蛋白，沒有檢測到ZmFAH-HA蛋白，該結(jié)果證明了ZmFBL41蛋白的LRR結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)也能夠與ZmFAH互作。圖3免疫共沉淀實驗驗證ZmFBL41B73LRR與ZmFAH的互作Fig.3TheinteractionbetweenZmFBL41B73LRRandZmFAHwasverifiedbyco-immunocoprecipitation（A）pCXUN-HA::ZmFAH載體構(gòu)建，ZmFAHCDS區(qū)擴(kuò)增（圖3A左1）及GV3101菌落PCR（圖3A右1-3）M，DL2000DNAMaker（B）pCXUN-Myc::ZmFBL41B73LRR載體構(gòu)建，LRR片段擴(kuò)增（圖3B左1）GV3101菌落PCR（圖3B右1-3）M，DL2000DNAMaker（C）蛋白免疫印記檢測Co-ip結(jié)果(A)VectorconstructionofpCXUN-HA::ZmFAH，CDSamplificationofZmFAH(leftinFig.3A1)andPCRdetectionofAgrobacteriumGV3101(rightinFig.3A1-4)M,DL2000DNAMaker(B)VectorconstructionofpCXUN-Myc::ZmFBL41B73LRR，CDSamplificationofpCXUN-Myc::ZmFBL41B73LRR(leftinFig.3B1)andPCRdetectionofAgrobacteriumGV3101(rightinFig.3B1-4)M,DL2000DNAMaker(C)Co-IPresultofwesternblotting3.4Pull-down實驗驗證ZmFBL41蛋白與ZmFAH蛋白的直接互作為進(jìn)一步證明ZmFBL41蛋白與ZmFAH蛋白的直接互作，將ZmFAH構(gòu)建到pMAL-c2x載體中，將ZmFBL41構(gòu)建到pET-28a載體中；分別導(dǎo)入原核表達(dá)菌株BL21DE3大腸桿菌（圖4AZmFAH1365bp，BZmFBL411008bp）。經(jīng)活化、擴(kuò)大培養(yǎng)、蛋白誘導(dǎo)、蛋白表達(dá)、細(xì)胞破碎、蛋白收集，通過SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色確定各蛋白正常表達(dá)（圖4C）。將ZmFAH-MBP和ZmFB
本文編號：3339551
【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省
【文章頁數(shù)】：55 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
候選基因CDS區(qū)擴(kuò)增Fig.1CDSamplificationofcandidategenes
ZmFBL41互作蛋白ZmFAH在玉米紋枯病抗性中的功能驗證26ZmFBL41B73LRR誘餌載體同時導(dǎo)入Y2HGold菌株中，以pGADT7載體與pGBKT7::ZmFBL41B73LRR同時轉(zhuǎn)化Y2HGold菌株作為陰性對照。所有轉(zhuǎn)化酵母涂布到SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，將陽性酵母菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，依次按照濃度梯度對應(yīng)加到SD/-Trp-Leu和SD/-Ade-His-Trp-Leu培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)果（圖2）顯示：在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上所有酵母菌株都能夠正常生長，而在SD/-Ade-His-Trp-Leu培養(yǎng)基上只有同時轉(zhuǎn)有pGBKT7::ZmFBL41B73LRR和pGADT7::ZmFAH載體的酵母菌株正常生長，而轉(zhuǎn)有其他三個蛋白的酵母菌株不能生長，說明ZmFAH蛋白能夠與ZmFBL41的LRR結(jié)構(gòu)域互作，因此將ZmFAH蛋白作為候選蛋白進(jìn)行深入研究。圖2酵母雙雜交驗證ZmFBL41蛋白LRR結(jié)構(gòu)域與候選蛋白的互作Fig.2ValidationoftheinteractionbetweentheLRRdomainofZmFBL41andeachcandidateproteinsusingyeasttwo-hybridization3.3免疫共沉淀實驗驗證ZmFBL41蛋白LRR結(jié)構(gòu)域與ZmFAH蛋白互作首先將ZmFBL41B73LRR構(gòu)建到pCXUN-Myc載體中，將ZmFAH構(gòu)建到pCXUN-HA載體中，分別導(dǎo)入到農(nóng)桿菌GV3101，利用載體引物Ubi-F和片段自身引物通過PCR對農(nóng)桿菌進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)（圖3A左ZmFAH1365bp，右1465bp圖3B左ZmFBL41B73LRR323bp，右423bp）。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時表達(dá)技術(shù)在本生煙葉片中表達(dá)ZmFBL41蛋白的LRR結(jié)構(gòu)域和ZmFAH蛋白，提取總蛋白后進(jìn)行免疫共沉淀并通過western
山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文27blotting進(jìn)行檢測。結(jié)果表明（圖3C），在Input樣品中，對照組和實驗組均能夠檢測到相應(yīng)的蛋白條帶，說明蛋白均被正常表達(dá)；經(jīng)HA磁珠的IP操作后，實驗組檢測到ZmFAH-HA蛋白，也檢測到了ZmFBL41B73LRR-Myc蛋白；而對照組僅檢測到ZmFBL41B73LRR蛋白，沒有檢測到ZmFAH-HA蛋白，該結(jié)果證明了ZmFBL41蛋白的LRR結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)也能夠與ZmFAH互作。圖3免疫共沉淀實驗驗證ZmFBL41B73LRR與ZmFAH的互作Fig.3TheinteractionbetweenZmFBL41B73LRRandZmFAHwasverifiedbyco-immunocoprecipitation（A）pCXUN-HA::ZmFAH載體構(gòu)建，ZmFAHCDS區(qū)擴(kuò)增（圖3A左1）及GV3101菌落PCR（圖3A右1-3）M，DL2000DNAMaker（B）pCXUN-Myc::ZmFBL41B73LRR載體構(gòu)建，LRR片段擴(kuò)增（圖3B左1）GV3101菌落PCR（圖3B右1-3）M，DL2000DNAMaker（C）蛋白免疫印記檢測Co-ip結(jié)果(A)VectorconstructionofpCXUN-HA::ZmFAH，CDSamplificationofZmFAH(leftinFig.3A1)andPCRdetectionofAgrobacteriumGV3101(rightinFig.3A1-4)M,DL2000DNAMaker(B)VectorconstructionofpCXUN-Myc::ZmFBL41B73LRR，CDSamplificationofpCXUN-Myc::ZmFBL41B73LRR(leftinFig.3B1)andPCRdetectionofAgrobacteriumGV3101(rightinFig.3B1-4)M,DL2000DNAMaker(C)Co-IPresultofwesternblotting3.4Pull-down實驗驗證ZmFBL41蛋白與ZmFAH蛋白的直接互作為進(jìn)一步證明ZmFBL41蛋白與ZmFAH蛋白的直接互作，將ZmFAH構(gòu)建到pMAL-c2x載體中，將ZmFBL41構(gòu)建到pET-28a載體中；分別導(dǎo)入原核表達(dá)菌株BL21DE3大腸桿菌（圖4AZmFAH1365bp，BZmFBL411008bp）。經(jīng)活化、擴(kuò)大培養(yǎng)、蛋白誘導(dǎo)、蛋白表達(dá)、細(xì)胞破碎、蛋白收集，通過SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色確定各蛋白正常表達(dá)（圖4C）。將ZmFAH-MBP和ZmFB
本文編號：3339551
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