雞的卵泡發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜、高度協(xié)調(diào)的生理過程,而在卵泡的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程當(dāng)中伴隨著血管系統(tǒng)的增殖和衰退。作為卵巢組織中含量最豐富,功能最強(qiáng)大的促血管生成因子,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）能夠促進(jìn)血管新生和提高血管的通透性,對(duì)維持卵巢功能及卵泡發(fā)育起重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期通過高通量測(cè)序,發(fā)現(xiàn)miR-26a-5p在雞性成熟前后的卵巢組織中差異表達(dá),且在雞等級(jí)卵泡膜細(xì)胞中過表達(dá)miR-26a-5p篩選出許多與血管發(fā)育相關(guān)的差異基因,推測(cè)miR-26a-5p可能參與雞卵泡血管的發(fā)育調(diào)控。本研究對(duì)雞等級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞中miR-26a-5p調(diào)控VEGFA表達(dá)的分子機(jī)制進(jìn)行了分析,結(jié)果如下:1.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法揭示雞卵泡顆粒細(xì)胞中受miR-26a-5p調(diào)控的基因。在雞等級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞中過表達(dá)miR-26a-5p并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,以未過表達(dá)miR-26a-5p的顆粒細(xì)胞為對(duì)照,在過表達(dá)miR-26a-5p的等級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞中共篩選出了686個(gè)差異表達(dá)基因,其中326個(gè)顯著上調(diào),360個(gè)顯著下調(diào)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因多富集在apelin signaling pathway、TGF-βsign... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

雞不同發(fā)育時(shí)期的各級(jí)卵泡（李琴,2018）

雞卵泡顆粒細(xì)胞中miR-26a-5p調(diào)控VEGFA表達(dá)的分子機(jī)制研究10轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的主要轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF相結(jié)合，最后激活與細(xì)胞生存、增殖和分化等相關(guān)聯(lián)的靶基因的表達(dá)（Amerongenetal.,2009;MacDonaldetal.,2009）。圖1.2經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路簡(jiǎn)易圖（許兵，2011）Fig1.2SimplediagramofclassicalWnt/β-Cateninsignalpath（XuBing,2011）1.5.2β-catenin在卵泡發(fā)育中的作用β-catenin又名CTNNB1基因，與α-catenin、γ-catenin組成連環(huán)蛋白家族。β-catenin是一種相對(duì)分子質(zhì)量為8.8×104的蛋白分子，其中含有一個(gè)可防止蛋白水解的棒狀超螺旋結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程當(dāng)中具有極其重要的作用。β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中含量最多，在細(xì)胞膜和細(xì)胞核中也有少量存在（Liuetal.,2009）。β-catenin作為一種重要的調(diào)節(jié)因子在卵泡發(fā)育等方面有重要的作用。同日齡已開產(chǎn)的濟(jì)寧百日雞卵巢組織中β-catenin的表達(dá)量顯著上調(diào)（Wangetal.,2009），而敲除β-catenin的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞CYP19A1及雌激素的產(chǎn)生減弱（Hernandezetal.,2009），結(jié)果說明β-catenin參與卵巢卵泡的發(fā)育且促進(jìn)卵巢激素的生成。FSH與β-catenin在牛體內(nèi)協(xié)同調(diào)控顆粒細(xì)胞中激素的形成，雌激素高的卵泡中β-catenin表達(dá)量也隨之升高（Castanonetal.,2012），在臺(tái)灣紅宇母雞中高產(chǎn)母雞相比低產(chǎn)母雞中β-catenin的表達(dá)量顯著上調(diào)（Chenetal.,2007），結(jié)果說明β-catenin促進(jìn)性激素的形成且有利于提高母雞的產(chǎn)蛋率。在雞體內(nèi)，β-catenin促進(jìn)雌激素的形成從而有利于母雞輸卵管的發(fā)育（Baeetal.,2014）。以上研究均表明β-catenin參與卵巢卵泡激素的生成從而有利于卵泡的發(fā)育成熟。

雞卵泡顆粒細(xì)胞中miR-26a-5p調(diào)控VEGFA表達(dá)的分子機(jī)制研究1820s38個(gè)循環(huán)。熔解曲線：95℃1s；62℃15s；95℃1s。GAPDH用作內(nèi)參基因來分析試驗(yàn)結(jié)果。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，用DNAMAN6.0軟件設(shè)計(jì)定量PCR引物，引物在青島睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。2.2.3miR-26a-5p過表達(dá)顆粒細(xì)胞前后差異表達(dá)基因的篩選與驗(yàn)證2.2.3.1RNA-seq測(cè)序的樣品準(zhǔn)備將miR-26a-5pmimic和陰性對(duì)照NC轉(zhuǎn)染至顆粒細(xì)胞48h后提取總RNA，具體的操作步驟見2.2.2.1。等提取完畢后，檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度。2.2.3.2轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)⑻崛》蠘?biāo)準(zhǔn)的RNA樣本進(jìn)行測(cè)序，試驗(yàn)流程按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程執(zhí)行，試驗(yàn)流程見圖2.1。圖2.1轉(zhuǎn)錄組試驗(yàn)流程圖（北京諾禾致源公司）Fig2.1Theworkflowoftranscription（NovogeneTechnologies）

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3335738