MicroRNAs（miRNAs）是真核生物中一類長度約為22nt的內(nèi)源性非編碼小分子RNAs,可通過靶向目標(biāo)mRNAs造成對其切割或阻止其翻譯,對植物生長發(fā)育、應(yīng)對生物脅迫和非生物脅迫等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用。已有研究表明miR398在多種植物的脅迫響應(yīng)中扮演著重要角色。本研究基于CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù),創(chuàng)制了水稻（Oryza sativa L.）OsMIR398定向敲除突變體材料,進行了轉(zhuǎn)錄組測序、非生物逆境脅迫分析和農(nóng)藝性狀考察。同時探究了OsMIR398家族成員對靶基因OsCSD2剪切效率。本文主要的研究結(jié)果如下:1.對OsMIR398前體時空表達特性分析表明:OsMIR398a在水稻抽穗期的葉片中表達水平最高,OsMIR398b在抽穗期根中表達水平最高,說明OsMIR398家族成員在表達模式上具有明顯的差異。2.OsMIR398ab敲除突變體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示:突變體miR398ab-1和miR398ab-2表達上調(diào)的基因分別有136、176個,下調(diào)的基因分別有93、41個,表達水平產(chǎn)生顯著差異的基因有24個。經(jīng)預(yù)測發(fā)現(xiàn),OsMIR398a的特異靶基因有86個,Os... 

【文章來源】：電子科技大學(xué)四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

RNA指導(dǎo)下Cas9切割靶DNA的示意圖[57]

電子科技大學(xué)碩士學(xué)位論文20第三章結(jié)果與分析3.1OsMIR398前體的時空表達特性分析為了初步了解OsMIR398前體在水稻中的表達情況，本研究對其進行了時空表達特性分析。分別選取日本晴生長三周的水稻幼苗的根、莖、葉和抽穗期間水稻苗的根、莖、葉、葉鞘、穗進行提取RNA、反轉(zhuǎn)錄和qPCR實驗。其中，OsMIR398a選用引物miRNA398a-F和miRNA398a-R來進行PCR擴增，OsMIR398b選用引物miRNA398b-F和miRNA398b-R進行PCR擴增（引物具體序列見附表1）。結(jié)果顯示（圖3-1）：OsMIR398a在水稻抽穗期的葉片中表達水平最高，根和莖中其表達水平基本相同，在幼苗期的莖中最低，但幼苗的根中OsMIR398a表達水平最高。而OsMIR398b在抽穗期根中表達水平最高，在同時期的莖中表達最低，而在幼苗階段其在葉片中的表達水平最高。圖3-1OsMIR398前體的時空表達特性分析（通過T檢驗進行顯著性差異分析，若p<0.01則為極顯著差異（**），0.01<p<0.05則為顯著差異（*））3.2OsMIR398敲除突變體篩癬鑒定3.2.1OsMIR398a敲除突變體篩癬鑒定OsMIR398a的CRISPR-Cas9載體（pTL03）由本實驗室提供，其載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖3-2a所示。經(jīng)過水稻遺傳轉(zhuǎn)化，得到T0代再生材料。對T0代進行了陽性鑒定，目的片段大小為900bp，結(jié)果顯示再生植株全部為陽性（圖3-2b）。接著通過PCR-SSCP實驗對陽性材料進行了基因型鑒定，與野生型相比，其突變類型

第三章結(jié)果與分析21多樣化（圖3-2c）。選取3個代表性植株進行Sanger測序，其中pTL03-03-3植株堿基缺失較多，為-9bp/-21bp（圖3-2d）。圖3-2OsMIR398a敲除突變體T0代篩癬鑒定圖。a.OsMIR398a敲除載體示意圖；b.OsMIR398a敲除突變體T0代陽性檢測圖；c.OsMIR398a敲除突變體T0代SSCP檢測圖；d.OsMIR398a敲除突變體T0代部分植株測序結(jié)果將pTL03-03-3植株經(jīng)過自交后得到T1代種子，隨機選取部分T1代種子進行幼苗培養(yǎng)，以期篩選到無載體的材料。同樣，T1代材料也需要通過PCR先進行陽性鑒定實驗，目的片段大小為900bp（圖3-3a），經(jīng)檢測，pTL03-03-3-1、pTL03-03-3-9、pTL03-03-3-10、pTL03-03-3-15、pTL03-03-3-17植株不含載體。如圖3-3b所示，繼續(xù)對T1代材料進行突變體鑒定，發(fā)現(xiàn)這些材料經(jīng)過基因分離呈現(xiàn)出三種基因類型，即-9bp/-9bp、-9bp/-21bp和-21bp/-21bp。由于在SSCP圖中pTL03-03-3-1、pTL03-03-3-9、pTL03-03-3-10、pTL03-03-3-15、pTL03-03-3-17的帶型相同，因此選取pTL03-03-3-1進行Sanger測序圖（3-3c），pTL03-03-3-1的突變類型與pTL03-03-3相同。最后經(jīng)過篩癬鑒定獲得不含載體的T2代材料，用bcda

【參考文獻】：
碩士論文
[1]水稻OsMIR398定向敲除突變體創(chuàng)制及分析[D]. 田莉.電子科技大學(xué) 2018
[2]水稻理想株型定向突變體創(chuàng)制及分析[D]. 章登位.電子科技大學(xué) 2017
[3]基于毛狀根系統(tǒng)的丹參酮代謝調(diào)控相關(guān)基因功能研究[D]. 孫耿.電子科技大學(xué) 2017



本文編號：3319369