黃萎病是棉花主要病害之一,常常導(dǎo)致棉花生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)損失。在我國(guó),棉花黃萎病主要是由病原菌大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）引起的。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展,CRISPR/Cas 9系統(tǒng)已應(yīng)用于真菌基因功能研究,其中U6啟動(dòng)子是驅(qū)動(dòng)sgRNA轉(zhuǎn)錄的重要元件之一,但在大麗輪枝菌中U6啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度還不清楚。本研究旨在分析大麗輪枝菌內(nèi)源性U6啟動(dòng)子的長(zhǎng)度,為CRISPR/Cas 9系統(tǒng)應(yīng)用于大麗輪枝菌中提供依據(jù)。棉帚霉菌（Scopulariopsis gossypii）是帚霉屬中迄今發(fā)現(xiàn)的唯一能侵染植物的特例。原先研究發(fā)現(xiàn),用通用引物不能從該種中擴(kuò)增ITS區(qū),影響了分類研究。本研究利用三代測(cè)序獲得的rDNA序列,分析和揭示了通用引物不能擴(kuò)增的原因,并評(píng)價(jià)了 ITS區(qū)在帚霉屬中對(duì)分類的作用。1.大麗輪枝菌U6啟動(dòng)子的研究為分析U6啟動(dòng)子的長(zhǎng)度,利用一步連接法構(gòu)建四個(gè)不同長(zhǎng)度U6啟動(dòng)子敲除載體,采用PEG介導(dǎo)法對(duì)載體進(jìn)行原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。通過(guò)抗性篩選和PCR鑒定,獲得不同長(zhǎng)度U6啟動(dòng)子的突變體。為了明確不同長(zhǎng)度的U6啟動(dòng)子對(duì)U6 snRNA表達(dá)量的影響,選擇四個(gè)代表性突... 

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【部分圖文】：

圖１．１酵母的ｎ型啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)圖??

Ｓ３??丨丨＾?ｓａ???ＩＴＳ１?＋?ＩＴＳ２?＋?＋?＋?＋?＋??ｒｅｇｉｏｎ?＾?ｒｅｇｉｏｎ?＇＾１７５４＾．?ＮＬＣ２?Ｎ￥ｕｎ?＾??５＆Ａ２Ｒ?ＩＴＳｆｌｍｕｎ?ＮＬ４Ｂ?ＮＬ６６ｍｕｎ??ＩＴＳＩＯｍｕｎ?ＩＴＳ４＿ＫＹ０１?ＮＬ３Ｂ??１ＴＳ２＿ＫＹ０１?ＩＴＳ４＿ＫＹ０２??？??ＩＴＳ２＿ＫＹ０２?ＩＴＳ４＿ＫＹ０３??Ｉ?Ｉ??Ｓｕｂｓｅｔ?１?！?．??Ｓｕｂｓｅｔ?２?．?．??Ｓｕｂｓｅｔ?３??圖１．２真菌核糖體ＤＮＡ常用引物??Ｆｉｇ．１．２?Ｔｈｅ?ｃｏｍｍｏｎｌｙ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ｏｆ?Ｆｕｎｇａｌ?ｒｉｂｏｓｏｍａｌ?ＤＮＡ??（引自?ＨｉｒｏｋａｚｕＴｏｊｕｄｄＰＬｏＳＯＮＥ?（２０１２，７）?７）??然而這些通用引物也并非十全十美，有研究發(fā)現(xiàn)通用引物存在著與目標(biāo)真菌??序列不．匹配的情況，導(dǎo)致一些真菌亞群無(wú)法準(zhǔn)確分類（Ｂｅｌｌｅｍａｉｎｅ纟ａ／．，?２０１０）。??例如圖１．２中用于擴(kuò)增ＩＴＳ１區(qū)和ＩＴＳ２區(qū)的通用引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ３與大多數(shù)拒子??菌門的真菌序列不配，導(dǎo)致一些原本屬于擔(dān)子菌門的真菌被??歸到子囊菌門（ｄ＞ｓｃｏ／Ｋ［ｙｃｏｔｏ）和球囊菌門（＿Ｇ／ｏｗｍ？／ｗｊｃｏｔｏ）中?＿（ＢｅｌｌｅｍａｉｎＭｔ／／．，??２０１０）。Ｌｉ在鑒定棉帚霉菌ＩＴＳ１區(qū)和ＩＴＳ２區(qū)序列時(shí)發(fā)現(xiàn)，用多對(duì)常用的ＩＴＳ區(qū)??通用引物擴(kuò)增得到的１８Ｓ和ＩＴＳ１區(qū)序列在ＮＣＢＩ上對(duì)比后無(wú)法確定其是棉帚霉??菌（＆〇評(píng)／？／７＋〇／？相客〇＆９少７＋／），．但得到的５．８Ｓ和ＩＴＳ２區(qū)序列在ＮＣＢＩ上對(duì)＿．比后可??以確定其屬于帚霉屬因

本研究以８００?ｂｐ的大麗輪枝菌Ｕ６啟動(dòng)子作為候選啟動(dòng)子，分段截取長(zhǎng)度為５２７??ｂｐ、４２３?ｂｐ、３２３?ｂｐ和２３０?ｂｐ的Ｕ６啟動(dòng)子，截短后的Ｕ６啟動(dòng)子分別命名為??ＶｄＵ６－５Ｐ、ＶｄＵ６－４Ｐ、ＶｄＵ６－３Ｐ和ＶｄＵ６－２Ｐ。在大麗輪枝菌候選啟動(dòng)子上游設(shè)計(jì)??上游．同源臂的特異性引物（圖２．２）。通過(guò)在Ｕ６啟動(dòng)子和Ｕ６ｓｇＲＮＡ序列上的不??同區(qū)域設(shè)計(jì)下游同源臂的特異性引物，可擴(kuò)增得到不同位置的Ｄｏｗｎ片段（圖??２．２），．分另１）命名為?５００?ｄｏｗｎ、４００?ｄｏｗｎ、３００?ｄｏｗｎ?和?２００?ｄｏｗｉｕ?通過(guò)一輪?ＰＣＲ??獲得目的片段（圖２．．３Ａ）．后，利用一步融合（Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ?ｃｌｏｎｉｎｇ）試荊＇盒將新霉素??抗牲基因與上下游同源臂連接獲得目的片段（圖２．３Ｂ）。對(duì)目的片段進(jìn)行一輪ＰＣＲ??擴(kuò)增獲得大量片段（圖２．３Ｃ）后與Ｔ－載體連接，得到最終的基因敲除載體。??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3306601