本文關(guān)鍵詞：FPV復(fù)制非必需位點(diǎn)的篩選及重組病毒生物學(xué)特性比較，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：雞痘病毒(Fowlpox Virus,FPV)基因組龐大,其基因組由260~309 kb雙鏈DNA組成,含有大量的復(fù)制非必需區(qū)可以作為外源基因的插入位點(diǎn),可以容納25~30 kb的外源基因。而且,FPV只對禽類有感染性,病毒不能在哺乳動(dòng)物體內(nèi)增殖,使得FPV作為載體有很好的生物安全性。FPV作為動(dòng)物病毒的表達(dá)載體表現(xiàn)出了其獨(dú)特的優(yōu)越性。以FPV為載體的重組病毒活載體疫苗在近二十多年來取得了很大的進(jìn)展,特別是一些如禽流感、新城疫、傳染性喉氣管炎、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病及馬立克氏病等引起禽類疾病的病毒的保護(hù)性抗原基因已經(jīng)在FPV上成功表達(dá)。構(gòu)建以FPV為載體的重組病毒的過程中,首先要做的就是對病毒復(fù)制非必需區(qū)的選擇。但是,現(xiàn)在國內(nèi)在FPV重組位點(diǎn)的選擇上研究還比較少,而且重組位點(diǎn)的選擇會(huì)影響到重組病毒的復(fù)制能力及外源基因的表達(dá)水平。因此,篩選并優(yōu)化以我國的FPV疫苗株為基礎(chǔ)的復(fù)制非必需區(qū)是至關(guān)重要的,這也對以后構(gòu)建高效安全的重組FPV載體疫苗奠定基礎(chǔ)。本研究采用定向克隆的方法篩選FPV的復(fù)制非必需區(qū)。在復(fù)制非必需區(qū)的選擇上,盡量以不影響FPV的復(fù)制、毒力及生物學(xué)特性為基礎(chǔ)。為篩選高效的FPV基因組外源基因的插入位點(diǎn),本研究選擇FPV的FPV054基因內(nèi)部及FPV161與FPV162之間的基因間隔區(qū)作為重組位點(diǎn),構(gòu)建含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的轉(zhuǎn)移載體,以表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因的重組FPV(rFPV-gB)為親本病毒,通過在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中同源重組,制備表達(dá)綠色熒光蛋白報(bào)告基因的重組雞痘病毒,經(jīng)過3輪蝕斑純化篩選獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)EGFP的重組病毒,分別命名為rFPV054-EGFP和rFPV161-EGFP。將重組病毒與親本病毒連續(xù)傳代20代,通過對每5代病毒的PCR鑒定,檢測到外源基因在病毒的傳代過程中始終存在,且沒有發(fā)生改變;同時(shí),對外源基因表達(dá)的免疫印記檢測也進(jìn)一步證明了所表達(dá)的蛋白的抗原性;通過對每代病毒所感染的細(xì)胞的熒光觀察,發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白基因能穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)。復(fù)制動(dòng)力學(xué)比較證明重組病毒與親本毒株生長特性相似;對重組病毒及親本病毒病毒粒子的電鏡觀察證明兩者在形態(tài)結(jié)構(gòu)上相似;在CEF細(xì)胞上形成的蝕斑比較證明重組病毒與親本病毒形成的蝕斑大小及形狀相似。本研究獲得的兩個(gè)復(fù)制非必需位點(diǎn),為一個(gè)或多個(gè)其他動(dòng)物(禽病或哺乳動(dòng)物)病原的保護(hù)性抗原基因的插入提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。為進(jìn)一步構(gòu)建二價(jià)或多價(jià)疫苗,真正做到一次免疫同時(shí)防治多種疾病,提供廣闊的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：重組FPV 復(fù)制非必需區(qū) 外源基因 生物學(xué)特性
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文縮略表12-13
• 1 引言13-22
• 1.1 雞痘病毒13-14
• 1.1.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)13-14
• 1.1.2 理化特性14
• 1.1.3 宿主范圍14
• 1.2 FPV的基因組14-17
• 1.2.1 病毒的開放閱讀框15
• 1.2.2 末端反向重復(fù)序列15-16
• 1.2.3 FPV的功能基因16-17
• 1.3 FPV載體系統(tǒng)的最新研究進(jìn)展17-20
• 1.3.1 FPV重組病毒的早期歷史17
• 1.3.2 重組FPV在禽類上的應(yīng)用17-18
• 1.3.3 重組FPV的構(gòu)建18-20
• 1.4 重組FPV的應(yīng)用前景20
• 1.5 研究的目的與意義20-22
• 2 材料和方法22-34
• 2.1 材料22-24
• 2.1.1 毒株與細(xì)胞22
• 2.1.2 菌株和質(zhì)粒22
• 2.1.3 主要試劑22-23
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備23
• 2.1.5 部分溶液的配制方法23-24
• 2.2 方法24-34
• 2.2.1 病毒的擴(kuò)增與基因組的提取24
• 2.2.2 引物的設(shè)計(jì)24-25
• 2.2.3 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建25-29
• 2.2.4 接毒及轉(zhuǎn)染29-30
• 2.2.5 重組病毒的篩選與純化30
• 2.2.6 兩株重組病毒的鑒定30-31
• 2.2.7 重組病毒與親本病毒的生物學(xué)特性比較31-34
• 3 結(jié)果34-47
• 3.1 兩個(gè)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的構(gòu)建34-38
• 3.1.1 兩側(cè)同源臂及EGFP基因的PCR擴(kuò)增34
• 3.1.2 pMD18-T-同源臂質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定34-36
• 3.1.3 pUC18與同源臂構(gòu)建與鑒定36-37
• 3.1.4 pSY-EGFP質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定37
• 3.1.5 兩個(gè)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的構(gòu)建37-38
• 3.2 兩個(gè)轉(zhuǎn)移載體的轉(zhuǎn)染38-39
• 3.3 重組病毒的篩選及純化39
• 3.4 重組病毒的PCR鑒定39-40
• 3.5 重組病毒的外源基因表達(dá)鑒定40-41
• 3.6 重組病毒與親本病毒的生物學(xué)特性比較41-47
• 3.6.1 重組病毒與親本病毒形態(tài)觀察41-43
• 3.6.2 兩株重組病毒與親本病毒蝕斑比較43
• 3.6.3 重組病毒傳代過程外源基因穩(wěn)定性檢測43-44
• 3.6.4 外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性44-45
• 3.6.5 重組病毒與親本病毒毒價(jià)比較45
• 3.6.6 重組病毒與親本病毒生長曲線比較45-47
• 4 討論47-49
• 5 全文結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 致謝56-57
• 作者簡介57

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 楊明凡;崔保安;陳紅英;王學(xué)斌;魏戰(zhàn)勇;;傳染性喉氣管炎病毒gD基因重組禽痘病毒的制備、純化及初步鑒定[J];中國生物制品學(xué)雜志;2009年04期

2 朱羿龍;李昌;劉存霞;杜壽文;王茂鵬;葉飛;譚鵬;邢彬;劉繼;朱光澤;郭焱;金寧一;;表達(dá)猴免疫缺陷病毒Env蛋白的重組雞痘病毒的構(gòu)建和篩選[J];生物技術(shù)通訊;2014年03期

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 孫蕾;外源基因插入不同復(fù)制非必需區(qū)影響重組雞痘病毒抵抗母源抗體干擾的能力[D];揚(yáng)州大學(xué);2005年

  本文關(guān)鍵詞：FPV復(fù)制非必需位點(diǎn)的篩選及重組病毒生物學(xué)特性比較，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：329402