熱應激對動物健康和生殖功能均有明顯的負面影響。哺乳動物在長期的進化過程中形成了防止生精細胞過度凋亡而導致雄性不育的機制。睪丸支持細胞生成的乳酸不僅能為各級生精細胞提供營養(yǎng),還能增加生精細胞抗凋亡的能力;ERK1/2信號通路、HSP70在熱應激后細胞的生存反應中發(fā)揮了重要作用。然而,熱應激是否可以通過激活ERK1/2信號通路、增加HSP70的表達,促進睪丸支持細胞乳酸的生成目前還不清楚。因此,本試驗以仔豬睪丸支持細胞為試驗材料,43℃處理培養(yǎng)的支持細胞30 min,通過添加信號通路的抑制劑和RNA干涉技術,探索磷酸化ERK1/2在熱誘導的乳酸合成中的作用,以及磷酸化ERK1/2與HSP70表達之間的關系。本試驗以21日齡的仔豬睪丸為試驗材料,通過43℃培養(yǎng)箱處理睪丸支持細胞30 min模擬熱應激環(huán)境,然后在32℃培養(yǎng)箱恢復不同時間（0,1,2,4,6 h）。采用CCK-8試劑盒檢測細胞的活率;利用定量PCR檢測乳酸生成相關基因的表達,運用western blotting檢測細胞中ERK1/2的磷酸化水平和乳酸分泌相關蛋白的表達,收集細胞和培養(yǎng)液用乳酸檢測試劑盒進行乳酸分泌量的測定。根據已... 

【文章來源】：西南大學重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：75 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 睪丸支持細胞
        1.1.1 支持細胞的基本結構
        1.1.2 支持細胞的增殖和成熟
        1.1.3 支持細胞的功能
    1.2 睪丸支持細胞內乳酸合成及轉運
        1.2.1 支持細胞內乳酸合成及轉運
        1.2.2 乳酸的作用
    1.3 熱應激
        1.3.1 熱應激概述
        1.3.2 熱應激對睪丸內細胞的影響
    1.4 ERK1/2信號通路
        1.4.1 ERK1/2信號通路概述
        1.4.2 ERK1/2信號通路的生理功能
        1.4.3 ERK1/2信號通路與熱應激
    1.5 熱休克蛋白 70
        1.5.1 HSP70與熱應激反應
        1.5.2 HSP70與ERK1/2信號通路
        1.5.3 HSP70的其他功能
    1.6 展望
第二章 引言
第三章 試驗材料與方法
    3.1 試驗材料
        3.1.1 試驗動物
        3.1.2 主要試驗試劑和耗材
        3.1.3 主要試驗儀器
        3.1.4 主要試驗試劑的配制
    3.2 試驗方法
        3.2.1 支持細胞的分離培養(yǎng)
        3.2.2 支持細胞純度鑒定
        3.2.3 熱處理
        3.2.4 U0126處理
        3.2.5 RNA干擾
        3.2.6 細胞活性檢測
        3.2.7 蛋白檢測
        3.2.8 mRNA檢測
        3.2.9 乳酸測定
        3.2.10 LDH活性測定
    3.3 統計分析
第四章 試驗結果
    4.1 支持細胞的分離培養(yǎng)
    4.2 RNA完整性檢測
    4.3 熒光定量PCR擴增曲線和熔解曲線分析
    4.4 熱應激對ERK1/2磷酸化的影響及恢復時間的篩選
        4.4.1 熱應激對ERK1/2磷酸化的影響
        4.4.2 熱應激后細胞恢復時間的篩選
    4.5 抑制劑U0126對熱應激誘導乳酸合成量的影響
        4.5.1 U0126濃度的篩選
        4.5.2 U0126抑制作用的鑒定
        4.5.3 U0126對乳酸合成的影響
        4.5.4 U0126對LDH活性的影響
        4.5.5 U0126對ERK1/2磷酸化的影響
        4.5.6 U0126對HSP70蛋白表達的影響
        4.5.7 U0126對HSP70 mRNA水平的影響
        4.5.8 U0126對GLUT3和LDH A蛋白表達的影響
        4.5.9 U0126對SLC2A3和LDH A mRNA水平的影響
    4.6 ERK2 Si RNA對熱誘導乳酸合成量的影響
        4.6.1 ERK1及ERK2 siRNA干涉片段的篩選
        4.6.2 ERK1及ERK2 siRNA干涉作用的鑒定
        4.6.3 ERK2 siRNA對乳酸合成的影響
        4.6.4 ERK2 siRNA對LDH活性的影響
        4.6.5 ERK2 siRNA對ERK1/2磷酸化的影響
        4.6.6 ERK2 siRNA對HSP70蛋白表達的影響
        4.6.7 ERK2 siRNA對HSP70 mRNA水平的影響
        4.6.8 ERK2 siRNA對GLUT3和LDH A蛋白表達的影響
        4.6.9 ERK2 siRNA對SLC2A3和LDH A mRNA水平的影響
第五章 討論
第六章 結論
參考文獻
致謝
在讀期間參與的課題和發(fā)表的文章


【參考文獻】：
期刊論文
[1]奶牛熱應激的危害及控制[J]. 郭時金,張志美,付石軍,張穎,徐倩倩,王艷萍,沈志強.  家畜生態(tài)學報. 2013(03)
[2]種公豬熱應激的危害及對策[J]. 王立述,羅維平,張斌,丁秀紅.  山東畜牧獸醫(yī). 2011(12)
[3]Molecular basis of cryptorchidism-induced infertility[J]. LIU YiXun & LI XiXia State Key Laboratory of Reproductive Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China.  Science China（Life Sciences）. 2010(11)
[4]熱應激影響家畜繁殖機能的機理及其調控研究進展[J]. 郭亮,張敏紅.  中國畜牧獸醫(yī). 2008(09)
[5]熱應激對動物機體生理機能的影響[J]. 張慶茹,郭紅斌,張紅德.  動物醫(yī)學進展. 2007(01)
[6]觀察恒河猴隱睪（熱刺激）模型中睪丸細胞細胞外信號調節(jié)激酶1和2（ERK1/2）的激活[J]. Xue-Sen Zhang~+ Zhi-Hong Zhang~+ Shu-Hua Guo Wei Yang,Zhu-Qiang Zhang Jin-Xiang Yuan Xuan Jin Zhao-Yuan Hu Yi-Xun Liu State Key Laboratory of Reproductive Biology,Institute of Zoology,Chinese Academy of Sciences,25 Bei Si Huan Road West,Beijing 100081,China.  Asian Journal of Andrology. 2006(03)
[7]Heat Shock Protein 90 Indirectly Regulates ERK Activity by Affecting Raf Protein Metabolism[J]. Fei DOU Liu-Di YUAN Jing-Jing ZHU Department of Genetics and Development Biology,Southeast University Medical School,Nanjing 210009,China.  Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2005(07)

碩士論文
[1]HSP70對熱應激條件下仔豬睪丸支持細胞乳酸合成的影響[D]. 廖婷婷.西南大學 2016
[2]豬精液冷凍保存的研究[D]. 周鑫.內蒙古大學 2012



本文編號：3284243