松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）引起的松材線蟲病是世界性檢疫病害,自1982年傳入我國(guó),其適生區(qū)不斷擴(kuò)展,多樣性的寄主植物和媒介昆蟲,一定程度上加大了松材線蟲病防治的難度。溫度作為一個(gè)關(guān)鍵環(huán)境因子,可以影響松材線蟲的生命過程。前期,本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對(duì)在15℃和25℃兩種不同溫度條件下,松材線蟲成蟲響應(yīng)溫度的表型開展了部分研究,本研究采用組學(xué)測(cè)序的方法,探究松材線蟲成蟲在響應(yīng)溫度時(shí)轉(zhuǎn)錄水平的變化,嘗試針對(duì)松材線蟲的發(fā)育繁殖相關(guān)的基因進(jìn)行篩選分析;并針對(duì)松材線蟲性別決定基因mog,分析其在不同蟲態(tài)下、不同溫度下的轉(zhuǎn)錄差異,并采用RNA干擾的方法,分析其對(duì)松材線蟲發(fā)育繁殖的影響。主要結(jié)果如下:1.松材線蟲在15℃與25℃兩種溫度條件下馴化的成蟲在轉(zhuǎn)錄水平上有明顯的差異,與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)代謝以及生殖發(fā)育相關(guān)的基因在溫度響應(yīng)上表現(xiàn)出典型的差異性特征。松材線蟲成蟲典型信號(hào)路徑中具有差異的基因hsp72、cbp-1、unc-68、ctl-2在15℃條件下基因上調(diào)表達(dá);松材線蟲成蟲的脂質(zhì)代謝途徑中相關(guān)基因pod-2、alh-12、asm-3、fat-2、fat-7、gpdh... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
1 引言
    1.1 松材線蟲及松材線蟲病
        1.1.1 松材線蟲寄主植物及媒介昆蟲
        1.1.2 松材線蟲生活史
        1.1.3 松材線蟲致病機(jī)理
        1.1.4 松材線蟲及松材線蟲病防治措施
    1.2 溫度影響線蟲的生命活動(dòng)
        1.2.1 溫度對(duì)松材線蟲生命活動(dòng)的影響
        1.2.2 溫度對(duì)其他植物寄生線蟲生命活動(dòng)的影響
        1.2.3 線蟲具有響應(yīng)并適應(yīng)低溫的能力
    1.3 線蟲的發(fā)育繁殖
        1.3.1 線蟲的生殖發(fā)育及dauer期線蟲形成
        1.3.2 線蟲的性別決定與性別分化
    1.4 本研究的目的和意義
2 試驗(yàn)材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株與蟲株
        2.1.2 溶液配制
        2.1.3 培養(yǎng)基配制
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 生化及分子生物學(xué)試劑
        2.1.6 引物設(shè)計(jì)與合成
    2.2 方法
        2.2.1 松材線蟲在不同溫度環(huán)境下的持續(xù)馴化培養(yǎng)試驗(yàn)
            2.2.1.1 松材線蟲蟲株的活化
            2.2.1.2 松材線蟲蟲株持續(xù)馴化培養(yǎng)
        2.2.2 松材線蟲的分離、收集、清洗
            2.2.2.1 松材線蟲的分離
            2.2.2.2 松材線蟲的收集
            2.2.2.3 松材線蟲的清洗
        2.2.3 松材線蟲蟲體總RNA的提取
        2.2.4 松材線蟲蟲體總RNA的反轉(zhuǎn)錄
        2.2.5 松材線蟲蟲體總RNA轉(zhuǎn)錄組分析
            2.2.5.1 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性評(píng)估
            2.2.5.2 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲基因表達(dá)水平分析
            2.2.5.3 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲基因差異表達(dá)分析
            2.2.5.4 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲生長(zhǎng)發(fā)育分析
        2.2.6 松材線蟲mog基因的分析
            2.2.6.1 松材線蟲mog基因的堿基序列分析
            2.2.6.2 松材線蟲mog基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析
            2.2.6.3 松材線蟲mog基因的表達(dá)水平分析
            2.2.6.4 松材線蟲mog基因的功能通路分析
        2.2.7 松材線蟲RNA干擾所用外源dsRNA合成
            2.2.7.1 mog-2和gfp基因特異性片段克隆
            2.2.7.2 mog-2和gfp基因特異性片段PCR產(chǎn)物的純化回收
            2.2.7.3 mog-2和gfp基因特異性片段連接表達(dá)載體pMD19-T
            2.2.7.4 mog-2和gfp重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α
            2.2.7.5 mog-2和gfp重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化子的菌液PCR驗(yàn)證
            2.2.7.6 mog-2和gfp成功轉(zhuǎn)化的重組表達(dá)載體的提取
            2.2.7.7 T7-mog-2和T7-gfp特異性片段擴(kuò)增及載體構(gòu)建
            2.2.7.8 T7-mog-2和T7-gfp特異性片段線性雙鏈DNA擴(kuò)增及純化
            2.2.7.9 T7-mog-2和T7-gfp特異性片段的dsRNA合成
        2.2.8 T7-mog-2和T7-gfp特異性片段DSRNA浸染松材線蟲二齡幼蟲
        2.2.9 外源dsRNA對(duì)松材線蟲二齡幼蟲的影響
            2.2.9.1 外源dsRNA能否進(jìn)入松材線蟲二齡幼蟲體內(nèi)并表達(dá)
            2.2.9.2 外源dsRNA對(duì)松材線蟲二齡幼蟲存活率的影響
            2.2.9.3 外源dsRNA對(duì)松材線蟲二齡幼蟲蠕動(dòng)行為的影響
            2.2.9.4 外源dsRNA對(duì)松材線蟲二齡幼蟲取食行為的影響
            2.2.9.5 外源dsRNA對(duì)松材線蟲二齡幼蟲發(fā)育的影響
3 結(jié)果與分析
    3.1 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
        3.1.1 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性分析
        3.1.2 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)水平分析
        3.1.3 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲轉(zhuǎn)錄組基因差異表達(dá)分析
            3.1.3.1 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲轉(zhuǎn)錄組差異基因GO分析
            3.1.3.2 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲轉(zhuǎn)錄組差異基因KEGG富集分析
        3.1.4 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑分析
        3.1.5 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲脂質(zhì)代謝分析
        3.1.6 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲生殖發(fā)育基因分析
            3.1.6.1 松材線蟲daf基因家族分析
            3.1.6.2 松材線蟲dpy基因家族分析
            3.1.6.3 松材線蟲HOX基因簇分析
            3.1.6.4 松材線蟲mog基因家族分析
            3.1.6.5 松材線蟲性別決定與性別分化基因分析
    3.2 松材線蟲性別決定基因mog的分析
        3.2.1 松材線蟲性別決定基因mog的堿基序列分析
        3.2.2 松材線蟲性別決定基因mog的編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析
            3.2.2.1 松材線蟲MOG蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)分析
            3.2.2.2 松材線蟲MOG蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
            3.2.2.3 松材線蟲MOG蛋白結(jié)構(gòu)域分析
            3.2.2.4 松材線蟲MOG蛋白3D結(jié)構(gòu)分析
        3.2.3 松材線蟲mog基因的表達(dá)水平分析
        3.2.4 松材線蟲mog基因的功能通路分析
        3.2.5 松材線蟲mog-2基因的功能研究
            3.2.5.1 松材線蟲混合蟲態(tài)蟲體總RNA的提取
            3.2.5.2 mog-2和gfp基因特異性片段克隆與重組載體的菌液PCR驗(yàn)證
            3.2.5.3 T7-mog-2和T7-gfp特異性片段克隆與重組載體的菌液PCR驗(yàn)證
            3.2.5.4 T7-mog-2和T7-gfp特異性片段線性雙鏈DNA擴(kuò)增
            3.2.5.5 T7-mog-2和T7-gfp特異性片段的dsRNA合成
            3.2.5.6 外源dsRNA能否進(jìn)入松材線蟲二齡幼蟲體內(nèi)并表達(dá)
            3.2.5.7 外源dsRNA對(duì)松材線蟲二齡幼蟲存活率的影響
            3.2.5.8 外源dsRNA對(duì)松材線蟲二齡幼蟲蠕動(dòng)行為的影響
            3.2.5.9 外源dsRNA對(duì)松材線蟲二齡幼蟲取食行為的影響
            3.2.5.10 外源dsRNA對(duì)松材線蟲二齡幼蟲發(fā)育的影響
4 討論
    4.1 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
        4.1.1 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑分析
        4.1.2 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲脂質(zhì)代謝分析
        4.1.3 松材線蟲15℃和25℃馴化下成蟲生殖發(fā)育基因分析
    4.2 松材線蟲mog基因的分析
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況



本文編號(hào)：3200015