發(fā)布時(shí)間：2017-04-21 08:13

  本文關(guān)鍵詞：豬轉(zhuǎn)鐵蛋白受體與PPV-VP2相互作用的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)是位于細(xì)胞膜上的Ⅱ型跨膜糖蛋白,能夠介導(dǎo)含鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白從胞外轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)。豬細(xì)小病毒(PPV)的基因組由長(zhǎng)度約為5000nt的單股負(fù)鏈DNA構(gòu)成,可編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1,VP2及VP2)及三種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1,NS2及NS3)。VP2占據(jù)病毒衣殼的絕大部分,約80%,并且能夠自我組裝成類病毒粒子。病毒的感染和復(fù)制起始于其與細(xì)胞表面受體的結(jié)合,這也是影響病毒宿主特異性、致病性及組織嗜性的關(guān)鍵因素之一。已有研究證實(shí),與PPV同屬的犬細(xì)小病毒(CPV)和貓瘟熱病毒(FPV)的細(xì)胞表面受體是TfR,通過病毒的VP2蛋白與其結(jié)合,進(jìn)而感染細(xì)胞。盡管PPV與CPV衣殼蛋白氨基酸的組成不盡相同,但其同源性較高,可達(dá)50~60%。基于此同源性可推測(cè)PPV也能夠通過VP2與細(xì)胞表面的TfR結(jié)合,進(jìn)而感染細(xì)胞。然而,很少有明確的證據(jù)表明,TfR是PPV的細(xì)胞表面受體,甚至有些證據(jù)表明,TfR不是PPV的細(xì)胞表面受體。為了明確TfR是否為PPV的受體,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前期的準(zhǔn)備以及一些初步檢測(cè),主要包括定量PCR檢測(cè)方法的建立、蛋白的表達(dá)及相互作用的初步鑒定、穩(wěn)定表達(dá)豬TfR的HEK293細(xì)胞系的建立等。本研究針對(duì)PPV VP2、Tf R和管家基因β-actin的序列設(shè)計(jì)了特異性的引物,分別建立了SYBRGreen熒光定量PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明:所構(gòu)建的熒光定量PCR檢測(cè)方法均無非特異性擴(kuò)增,檢測(cè)下線均在10拷貝以內(nèi),變異系數(shù)均小于3%。本研究建立的SYBR Green熒光定量PCR方法重復(fù)性好、敏感性高、特異性強(qiáng),適用于對(duì)PPV及TfR的定量檢測(cè)。利用所建立的SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)PPV感染ST前后PPV的增殖情況及TfR的轉(zhuǎn)錄時(shí)象進(jìn)行了對(duì)應(yīng)檢測(cè)分析,結(jié)果表明:PPV在感染ST細(xì)胞前后消耗了一定的豬TfR來進(jìn)行自身的增殖,TfR消耗特征符合作為PPV的細(xì)胞表面受體的特征。免疫共沉淀是一種研究蛋白之間相互作用的方法,本研究分別構(gòu)建了VP2和TfR的重組表達(dá)質(zhì)粒,利用激光共聚焦試驗(yàn)證實(shí)了VP2蛋白和TfR蛋白可在細(xì)胞膜上共定位,進(jìn)一步才用免疫共沉淀試驗(yàn)驗(yàn)證二者是否具有相互作用,結(jié)果表明:二者不存在直接相互作用或不具有相互作用。為進(jìn)一步探索二者的相互作用,本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)豬TfR的HEK293細(xì)胞系并對(duì)其進(jìn)行了鑒定,結(jié)果表明,所構(gòu)建的細(xì)胞系TfR基因的整合效率達(dá)90%以上,蛋白的表達(dá)效率也較高。而PPV對(duì)該細(xì)胞的感染試驗(yàn)表明PPV對(duì)該細(xì)胞不具有感染能力。以上試驗(yàn)結(jié)果表明TfR不是PPV的細(xì)胞表面受體,PPV的細(xì)胞表面受體還有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：豬細(xì)小病毒 豬轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 熒光定量PCR 免疫共沉淀 穩(wěn)定細(xì)胞系
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要7-8
• Abstract8-15
• 英文縮略表15-16
• 第一章 引言16-23
• 1.1 豬細(xì)小病毒的研究進(jìn)展16-19
• 1.1.1 PPV的病原學(xué)16-17
• 1.1.2 基因組結(jié)構(gòu)17-18
• 1.1.3 基因組的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄18
• 1.1.4 PPV基因組編碼蛋白和功能18-19
• 1.2 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的研究進(jìn)展19-21
• 1.2.1 TfR的結(jié)構(gòu)19-20
• 1.2.2 TfR的功能20-21
• 1.3 病毒的細(xì)胞受體21-22
• 1.3.1 細(xì)胞表面病毒受體的研究方法21
• 1.3.2 TfR作為病毒細(xì)胞受體的研究進(jìn)展21-22
• 1.4 本研究的目的和意義22-23
• 第二章 熒光定量PCR方法的建立及應(yīng)用23-34
• 2.1 材料23
• 2.1.1 細(xì)胞、毒株及主要試劑23
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備23
• 2.2 方法23-26
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)23-24
• 2.2.2 PPV在ST細(xì)胞上的增殖實(shí)驗(yàn)24
• 2.2.3 病毒DNA的提取24
• 2.2.4 病毒及細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄24-25
• 2.2.5 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立25
• 2.2.6 敏感性分析25-26
• 2.2.7 特異性分析26
• 2.2.8 重復(fù)性分析26
• 2.2.9 PPV增殖曲線的建立26
• 2.2.10 熒光定量PCR方法檢測(cè)PPV感染ST細(xì)胞后PPV增殖情況及TfRmRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化26
• 2.2.11 統(tǒng)計(jì)分析26
• 2.3 結(jié)果26-32
• 2.3.1 熒光定量PCR的引物特異性鑒定26-27
• 2.3.2 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立27-30
• 2.3.3 敏感性分析結(jié)果30
• 2.3.4 特異性分析結(jié)果30-31
• 2.3.5 重復(fù)性分析結(jié)果31
• 2.3.6 PPV的增殖曲線31-32
• 2.3.7 PPV感染后的TfR的轉(zhuǎn)錄實(shí)相32
• 2.4 討論32-34
• 第三章 TfR和VP2的真核表達(dá)34-45
• 3.1 材料34-35
• 3.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒及主要試劑34
• 3.1.2 主要儀器34-35
• 3.2 方法35-40
• 3.2.1 引物的設(shè)計(jì)35
• 3.2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建35-38
• 3.2.3 HEK293T細(xì)胞的復(fù)蘇38
• 3.2.4 HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)38
• 3.2.5 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染38
• 3.2.6 Western blot檢測(cè)38-39
• 3.2.7 激光共聚焦實(shí)驗(yàn)39
• 3.2.8 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)39-40
• 3.3 結(jié)果40-44
• 3.3.1 目的基因的擴(kuò)增結(jié)果40
• 3.3.2 重組質(zhì)粒的鑒定40-41
• 3.3.3 Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá)41-42
• 3.3.4 用激光共聚焦實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VP2蛋白和TfR蛋白的共定位42
• 3.3.5 用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VP2蛋白和TfR蛋白的相互作用42-44
• 3.4 討論44-45
• 第四章 穩(wěn)定表達(dá)豬TfR的HEK293細(xì)胞系的建立45-57
• 4.1 材料45-46
• 4.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和菌種45
• 4.1.2 主要試劑45
• 4.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器45-46
• 4.2 方法46-51
• 4.2.1 引物的設(shè)計(jì)46
• 4.2.2 pLVX-TfR-His重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定46-48
• 4.2.3 TfR在HEK293T細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)及western blot鑒定48
• 4.2.4 重組慢病毒包裝及病毒滴度的測(cè)定48-49
• 4.2.5 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞篩選49-50
• 4.2.6 篩選細(xì)胞的鑒定50
• 4.2.7 病毒感染實(shí)驗(yàn)50-51
• 4.3 結(jié)果51-56
• 4.3.1 重組慢病毒載體的構(gòu)建51
• 4.3.2 HEK293T細(xì)胞的綠色熒光檢測(cè)及western blot鑒定51-52
• 4.3.3 重組慢病毒包裝及病毒滴度的測(cè)定52
• 4.3.4 HEK293-TfR細(xì)胞及HEK293-ZsGreen細(xì)胞的篩選52-53
• 4.3.5 篩選細(xì)胞的鑒定53-54
• 4.3.6 病毒感染試驗(yàn)54-56
• 4.4 討論56-57
• 第五章 全文結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-65
• 致謝65-66
• 作者簡(jiǎn)歷66

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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  本文關(guān)鍵詞：豬轉(zhuǎn)鐵蛋白受體與PPV-VP2相互作用的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：319921