小麥（Triticum aestivum L.）是世界三大糧食作物之一。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是小麥基因功能研究的主要手段,但較低的植物再生能力限制了高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立,阻礙了小麥功能基因組學(xué)分析和基因工程育種的有效開展。建立高效的再生體系對于小麥高效遺傳轉(zhuǎn)化和基因功能研究具有重要意義。本研究從小麥中克隆了轉(zhuǎn)錄因子LEAFY COTYLEDON 1（LEC1）和LEC2的同源基因并進(jìn)行了進(jìn)化樹和時(shí)空表達(dá)模式分析,進(jìn)而對該基因在小麥中的生物學(xué)功能進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下:本研究用擬南芥LEC2的全長氨基酸序列,在Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST檢索。結(jié)果表明,TaLEC2基因位于3號染色體上。以中國春和Fielder的胚為材料,設(shè)計(jì)特異性引物,利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得了三個(gè)TaLEC2基因,分別命名為TaLEC2-3A、TaLEC2-3B和TaLEC2-3D,它們分別編碼248、405和301個(gè)氨基酸,含有B3結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),TaLEC2s與擬南芥的LEC2在同一分支上。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,TaLEC2蛋白均定位在細(xì)胞核內(nèi)。qRT-PCR分析結(jié)果顯示,... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
abstract
1 前言
    1.1 小麥籽粒大小和粒重的研究現(xiàn)狀
    1.2 小麥再生和遺傳轉(zhuǎn)化的研究現(xiàn)狀
    1.3 轉(zhuǎn)錄因子LEC1和LEC2的功能
        1.3.1 LEC1和LEC2轉(zhuǎn)錄因子對胚胎發(fā)育的影響
        1.3.2 LEC1和LEC2轉(zhuǎn)錄因子對種子成熟和存儲化合物積累的影響
        1.3.3 LEC1和LEC2轉(zhuǎn)錄因子對種子大小的影響
    1.4 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料與其生長培養(yǎng)條件
        2.1.2 菌株與質(zhì)粒載體
        2.1.3 酶及其生化試劑
        2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.5 引物序列合成
        2.1.6 DNA測序
        2.1.7 實(shí)驗(yàn)引物
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 植物組織中總RNA的提取
        2.2.2 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈的cDNA
        2.2.3 植物組織中DNA的提取
        2.2.4 培養(yǎng)基的配置
        2.2.5 克隆構(gòu)建載體
            2.2.5.1 PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段
            2.2.5.2 目的片段的膠回收
            2.2.5.3 載體的連接與轉(zhuǎn)化
            2.2.5.4 質(zhì)粒DNA的提取
        2.2.6 表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.6.1 酶切連接反應(yīng)
            2.2.6.2 表達(dá)載體的連接轉(zhuǎn)化
        2.2.7 根瘤農(nóng)桿菌的連接轉(zhuǎn)化
        2.2.8 DNA產(chǎn)物純化
        2.2.9 小麥TaLEC-OX、amiRLEC和TaLEC2-DOWN表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.10 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
        2.2.11 轉(zhuǎn)基因小麥陽性植株的鑒定
            2.2.11.1 bar試紙條鑒定
            2.2.11.2 PCR鑒定
        2.2.12 mRNA原位雜交實(shí)驗(yàn)
            2.2.12.1 小麥胚的固定與包埋
            2.2.12.2 制備探針
            2.2.12.3 組織切片
            2.2.12.4 脫蠟和復(fù)水
            2.2.12.5 雜交液的配制
            2.2.12.6 雜交后處理
            2.2.12.7 信號檢測
        2.2.13 蘇丹紅染色
        2.2.14 轉(zhuǎn)基因小麥幼胚石蠟切片實(shí)驗(yàn)
            2.2.14.1 材料的固定
            2.2.14.2 脫水與浸蠟
            2.2.14.3 復(fù)水和染色
        2.2.15 煙草的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化
3 結(jié)果與分析
    3.1 TaLEC2、TaLEC1基因的克隆和進(jìn)化樹分析
    3.2 TaLEC2、TaLEC1蛋白的亞細(xì)胞定位
    3.3 TaLEC2、TaLEC1基因的表達(dá)模式分析
    3.4 TaLEC基因在小麥中的遺傳轉(zhuǎn)化
    3.5 過表達(dá)TaLEC2和TaLEC1對體細(xì)胞胚和胚性細(xì)胞形成的影響
        3.5.1 過表達(dá)TaLEC2-3D對Fielder小麥胚性細(xì)胞的誘導(dǎo)作用
        3.5.2 TaLEC2-3D-OX對其它小麥種質(zhì)材料胚性細(xì)胞的誘導(dǎo)作用
        3.5.3 TaLEC2-3D-OX誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的組織學(xué)觀察
        3.5.4 TaLEC2-3D-OX誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的掃描電鏡觀察
        3.5.5 T2代TaLEC2-3D-OX轉(zhuǎn)基因小麥幼胚外植體上體細(xì)胞胚和胚性細(xì)胞團(tuán)的觀察
        3.5.6 TaLEC2-3D-OX愈傷組織中胚胎特異基因的表達(dá)
        3.5.7 TaLEC2-3D-OX愈傷組織中生長素合成基因的表達(dá)
    3.6 TaLEC2小麥轉(zhuǎn)基因植株的表型分析
        3.6.1 T0代TaLEC2小麥轉(zhuǎn)基因植株的基因型鑒定
        3.6.2 T1代TaLEC2小麥轉(zhuǎn)基因植株的表型分析
        3.6.3 T2代TaLEC2小麥轉(zhuǎn)基因植株的表型分析
4 討論
    4.1 TaLEC2基因調(diào)控體細(xì)胞胚的再生以及提高遺傳轉(zhuǎn)化效率
    4.2 TaLEC2基因調(diào)控小麥的籽粒大小和粒重
    4.3 TaLEC1基因促進(jìn)胚性細(xì)胞的產(chǎn)生
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]A reductionist approach to dissecting grain weight and yield in wheat[J]. Jemima Brinton,Cristobal Uauy.  Journal of Integrative Plant Biology. 2019(03)
[2]我國部分主推小麥品種組織培養(yǎng)再生能力評價(jià)[J]. 張偉,尹米琦,趙佩,王軻,杜麗璞,葉興國.  作物學(xué)報(bào). 2018(02)
[3]小麥規(guī)�；D(zhuǎn)基因技術(shù)體系構(gòu)建及其應(yīng)用[J]. 葉興國,徐惠君,杜麗璞,何光源,王軻,林志珊.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2014(21)
[4]不同生長素類型及ABA搭配對小麥幼胚再生效果的影響[J]. 別曉敏,杜麗璞,佘茂云,徐惠君,葉興國.  核農(nóng)學(xué)報(bào). 2011(05)
[5]小麥成熟胚高頻植株再生系統(tǒng)的建立[J]. 丁莉萍,何光源.  植物生理學(xué)通訊. 2004(02)
[6]小麥胚愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生[J]. 楊淑慎,郭振,徐虹.  西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2002(04)
[7]不同小麥基因型及其不同外植體離體培養(yǎng)研究初探[J]. 覃建兵,何光源.  華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2001(06)
[8]提高小麥愈傷組織分化頻率的因素[J]. 于曉紅,朱禎,付志明,安利佳,李向輝.  植物生理學(xué)報(bào). 1999(04)
[9]組織培養(yǎng)途徑改良定型小麥品種的研究[J]. 葉興國,徐惠君,趙樂蓮,杜麗璞.  作物學(xué)報(bào). 1998(03)
[10]用基因槍法將人工雄性不育基因?qū)胄←湹难芯砍鯃?bào)[J]. 傅榮昭,曹光誠,馬江生,李文彬,孫勇加,陳占寬,易明林,郅玉寶,林作輯.  遺傳學(xué)報(bào). 1997(04)



本文編號：3187270