發(fā)布時(shí)間：2017-04-20 02:18

  本文關(guān)鍵詞：日本對(duì)蝦MCM7克隆及其調(diào)控細(xì)胞吞噬作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：微染色體維持蛋白(Minichromosome Maintenance Protein, MCM7)隸屬于MCM蛋白家族,在真核生物中高度保守,參與MCMs復(fù)合體作為細(xì)胞復(fù)制周期的許可證和染色體復(fù)制起始因子。使用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)從日本對(duì)蝦(Marsupenaeus Japonicus)中克隆得到全長(zhǎng)為2307bp的cDNA序列,分析顯示該基因擁有1974bp大小的開(kāi)放閱讀框,編碼一個(gè)658aa蛋白,基因含有Poly(A)尾,5’和3’的非編碼區(qū)分別為139bp和191bp,蛋白序列BLAST發(fā)現(xiàn)同源性高于75%,進(jìn)化樹(shù)分析顯示該基因在真核動(dòng)物中高度保守,與魚(yú)類與爪蟾享有較近親緣關(guān)系。檢測(cè)基因表達(dá)的組織特異性發(fā)現(xiàn)MCM7表達(dá)在免疫器官包括血淋巴及肝胰腺中較高,消化腺內(nèi)表達(dá)水平次之,而在心臟、肌肉、鰓和后腸等組織內(nèi)表達(dá)量較低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),感染對(duì)蝦白班綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV)后,MCM7基因出現(xiàn)過(guò)表達(dá)。通過(guò)小RNA干擾技術(shù)(Short Interfering RNA, siRNA),設(shè)計(jì)并體外合成的siRNA注射處理對(duì)蝦,成功敲低MCM7的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)水平降低后,對(duì)蝦先天性免疫系統(tǒng)中多個(gè)重要基因受到影響,其中hemocyanin, proPO, TNF和P-actin的表達(dá)量上調(diào),而細(xì)胞骨架蛋白調(diào)控基因如myosin, Rho的表達(dá)量則下調(diào),則表明MCM7的表達(dá)對(duì)細(xì)胞吞噬作用有影響。通過(guò)RNAi技術(shù)抑制MCM7表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞吞噬率降低,表明MCM7對(duì)細(xì)胞吞噬有調(diào)控作用。并且MCM7表達(dá)被抑制后WSSV病毒的拷貝數(shù)上升,表明MCM7調(diào)控的細(xì)胞吞噬作用可能有利于抑制病毒復(fù)制。本研究首次在甲殼動(dòng)物中成功克隆MCM7,并揭示了MCM7在血細(xì)胞吞噬進(jìn)程中的角色,為甲殼動(dòng)物先天性免疫的進(jìn)一步研究提供了新的線索。
【關(guān)鍵詞】：日本對(duì)蝦 MCM7 分子克隆 對(duì)蝦白斑病毒 先天性免疫 細(xì)胞吞噬
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 引言8-14
• 1 日本對(duì)蝦MCM7基因全長(zhǎng)序列的克隆14-30
• 1.1 材料14-15
• 1.1.1 日本對(duì)蝦14
• 1.1.2 試劑與溶液14
• 1.1.3 儀器與設(shè)備14-15
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法15-23
• 1.2.1 樣品制備15
• 1.2.2 RNA提取15
• 1.2.3 快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)15-16
• 1.2.4 3’RACE16-18
• 1.2.5 5’RACE18-19
• 1.2.6 序列拼接19-21
• 1.2.7 克隆與測(cè)序21-22
• 1.2.8 測(cè)序結(jié)果分析22-23
• 1.3 結(jié)果分析23-29
• 1.3.1 3’序列23-24
• 1.3.2 5’序列24-25
• 1.3.3 全長(zhǎng)序列拼接與分析25-29
• 1.4 討論29
• 1.5 小結(jié)29-30
• 2 日本對(duì)蝦MCM7基因的表達(dá)與抑制30-43
• 2.1 材料30-31
• 2.1.1 日本對(duì)蝦30
• 2.1.2 WSSV粗提取30
• 2.1.3 試劑與溶液30
• 2.1.4 儀器與設(shè)備30-31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法31-37
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料處理31
• 2.2.2 RNA提取與cDNA合成31-32
• 2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)32-33
• 2.2.4 結(jié)果分析33
• 2.2.5 siRNA干擾設(shè)計(jì)33-35
• 2.2.6 體內(nèi)siRNA干擾試驗(yàn)35-36
• 2.2.7 體外siRNA干擾試驗(yàn)36-37
• 2.3 結(jié)果分析37-41
• 2.3.1 MCM7組織表達(dá)差異性與病原誘導(dǎo)表達(dá)變化分析37-38
• 2.3.2 siRNA體內(nèi)試驗(yàn)干擾MCM7表達(dá)38-39
• 2.3.3 siRNA體外試驗(yàn)干擾MCM7表達(dá)39-41
• 2.4 討論41-42
• 2.5 小結(jié)42-43
• 3 MCM7基因在日本對(duì)蝦免疫系統(tǒng)中的作用43-58
• 3.1 材料43
• 3.1.1 日本對(duì)蝦血細(xì)胞培養(yǎng)43
• 3.1.2 試劑與溶液43
• 3.1.3 儀器與設(shè)備43
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法43-48
• 3.2.1 siRNA敲低處理43
• 3.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)各通路基因變化43-44
• 3.2.3 WSSV提取與純化44-45
• 3.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)觀察試驗(yàn)45
• 3.2.5 病毒拷貝數(shù)試驗(yàn)45-46
• 3.2.6 死亡率(mortality)試驗(yàn)46-47
• 3.2.7 吞噬試驗(yàn)47-48
• 3.3 結(jié)果分析48-56
• 3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)觀察結(jié)果48-50
• 3.3.2 MCM7對(duì)其他主要免疫通路與免疫因子的影響50-52
• 3.3.3 MCM7對(duì)病毒入侵的影響52-54
• 3.3.4 MCM7對(duì)吞噬作用的影響54-56
• 3.4 討論56-57
• 3.5 小結(jié)57-58
• 結(jié)論58-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 個(gè)人簡(jiǎn)介64-65
• 致謝65

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本文編號(hào)：317700