發(fā)布時(shí)間：2021-04-24 06:26

　　J亞群禽白血病病毒（Avian leukosis viruses,ALV-J）是致禽類(lèi)腫瘤性疾病的病毒。該病毒于1988年首次在肉用型種雞群中發(fā)現(xiàn),1999年我國(guó)在肉雞中首次分離到ALV-J,此后該病毒一直在我國(guó)雞群中廣為流行,對(duì)我國(guó)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。p53作為一種抑癌基因,近年來(lái)在腫瘤性疾病中的研究非常廣泛,并且發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)腫瘤病的發(fā)生中p53突變?yōu)槠潢P(guān)鍵致病因素,p53逐漸受到人們的關(guān)注并成為研究的明星基因。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)p53突變及過(guò)表達(dá)與ALV-J的感染致病密切相關(guān)。為進(jìn)一步研究其致病機(jī)制,本試驗(yàn)以雞成纖維細(xì)胞系DF-1細(xì)胞為模式細(xì)胞,運(yùn)用靶向于雞p53的CRISPR-Cas9系統(tǒng)雙向敲除DF-1細(xì)胞,嘌呤霉素篩選陽(yáng)性克隆細(xì)胞,獲得敲除p53的DF-1細(xì)胞（p53-KO-DF-1）。將ALV-J感染DF-1和p53-KO-DF-1,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞基因組測(cè)序和熒光定量等方法檢測(cè)p53敲除對(duì)ALV-J感染細(xì)胞的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的影響。為進(jìn)一步研究p53突變對(duì)ALV-J病毒復(fù)制及致瘤機(jī)制的影響,我們構(gòu)建了p53野生型及突變型真核表達(dá)質(zhì)粒... 

【文章來(lái)源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：76 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
符號(hào)說(shuō)明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 J亞群禽白血病簡(jiǎn)介
        1.1.1 病原特征
        1.1.2 ALV-J致瘤機(jī)制
        1.1.3 ALV-J流行病學(xué)
        1.1.4 ALV-J感染雞的臨床表現(xiàn)及病理變化
    1.2 p53
        1.2.1 p53 基因的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 p53 基因及蛋白結(jié)構(gòu)
        1.2.3 p53 的功能
        1.2.4 p53 突變
    1.3 研究目的及意義
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞和病毒
        2.1.2 質(zhì)粒
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.4 主要試劑
        2.1.5 試驗(yàn)儀器和設(shè)備
        2.1.6 試劑配制
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 DF-1 細(xì)胞復(fù)蘇傳代與凍存
        2.2.2 ALV-J擴(kuò)增和病毒效價(jià)測(cè)定
        2.2.3 雞p53 重組蛋白的表達(dá)鑒定與純化
        2.2.4 p53 多克隆抗體的制備
        2.2.5 p53 多抗血清特異性的檢測(cè)
        2.2.6 雞p53 基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建
        2.2.7 p53-KO-DF-1 細(xì)胞系與野生型DF-1 細(xì)胞系中ALV-J感染復(fù)制相關(guān)機(jī)制的比較
        2.2.8 wtp53和mtp53對(duì)ALV-J感染復(fù)制及致瘤機(jī)制的影響
        2.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 wtp53和mtp53 重組質(zhì)粒的驗(yàn)證
        3.1.1 pEGFP-C1-p53 蛋白的免疫熒光檢測(cè)
        3.1.2 pEGFP-C1-p53 蛋白的Western Blot檢測(cè)
        3.1.3 激光共聚焦檢測(cè)wtp53和mtp53在DF-1 細(xì)胞中的定位
    3.2 ALV-J效價(jià)驗(yàn)證
    3.3 兔源p53 多克隆抗體制備
        3.3.1 雞p53 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
        3.3.2 測(cè)序結(jié)果分析
        3.3.3 pET-His-p53 原核重組蛋白的表達(dá)鑒定
        3.3.4 pET-His-p53 重組蛋白的純化結(jié)果
        3.3.5 兔源p53 多克隆抗體ELISA效價(jià)測(cè)定
        3.3.6 兔源p53 多克隆抗體Western Blot鑒定結(jié)果
    3.4 DF-1 細(xì)胞敲除p53 細(xì)胞系的構(gòu)建
        3.4.1 p53 敲除質(zhì)粒Px459M-Guide-p53-KO-325-625 的構(gòu)建
        3.4.2 篩選DF-1 細(xì)胞的嘌呤霉素濃度確定
        3.4.3 DF-1 細(xì)胞敲除p53 基因細(xì)胞系的建立
    3.5 p53-KO-DF-1 細(xì)胞系與野生型DF-1 細(xì)胞系中ALV-J感染復(fù)制相關(guān)機(jī)制的比較結(jié)果
        3.5.1 細(xì)胞增殖比較結(jié)果
        3.5.2 病毒復(fù)制比較結(jié)果
        3.5.3 腫瘤相關(guān)基因變化的比較結(jié)果
        3.5.4 細(xì)胞周期變化的比較結(jié)果
        3.5.5 細(xì)胞凋亡變化的比較結(jié)果
    3.6 野生型及突變型p53對(duì)ALV-J致瘤機(jī)制的影響
        3.6.1 野生型及突變型p53 對(duì)病毒復(fù)制的影響
        3.6.2 熒光定量檢測(cè)PCR對(duì)腫瘤相關(guān)基因的影響
        3.6.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期
        3.6.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        3.6.5 野生型及突變型p53 蛋白對(duì)ALV-J誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的影響
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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