黃酮類化合物是一種重要的藥用成分,不僅在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中參與紫外線防護(hù)、花色形成等過(guò)程,還具有抗腫瘤、抗癌等作用。而查爾酮異構(gòu)酶（CHI）和查爾酮合成酶（CHS）是黃酮類化合物合成途徑中的兩個(gè)限速酶,二者的表達(dá)與否對(duì)體內(nèi)黃酮物質(zhì)的合成具有關(guān)鍵的調(diào)控作用,因此,克隆出兩種酶基因,對(duì)其進(jìn)行功能分析,并利用基因工程技術(shù)調(diào)控黃酮物質(zhì)的合成,對(duì)提高黃酮含量、增加藥用價(jià)值或改變花色、提高花卉欣賞價(jià)值具有重要的意義,同時(shí)也可為植物黃酮類化合物合成途徑的遺傳調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。CHI與CHS廣泛存在于植物中,并已從多種植物中分離出這兩個(gè)酶基因。然而,綠豆作為一種富含黃酮物質(zhì)的重要經(jīng)濟(jì)作物,還未克隆出這兩個(gè)酶基因,因此,本研究以此為著手點(diǎn),克隆出綠豆CHI與CHS基因,并將CHI基因轉(zhuǎn)化煙草和大豆,對(duì)其功能進(jìn)行初步探究,具體研究結(jié)果如下：1、根據(jù)其它高等植物CHI cDNA序列保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)4條引物,結(jié)合RT-PCR,以綠豆葉片cDNA為模板,采用分段克隆的方法克隆出綠豆CHI基因片段,然后拼接成為具有完整ORF的序列。最后設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行驗(yàn)證,最終獲得完整ORF為669 bp的綠豆CHIcDNA全長(zhǎng)序... 

【文章來(lái)源】：福建農(nóng)林大學(xué)福建省

【文章頁(yè)數(shù)】：79 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 綠豆概況
        1.1.1 綠豆的藥用價(jià)值研究
        1.1.2 綠豆種質(zhì)資源的研究進(jìn)展
        1.1.3 綠豆基因克隆研究現(xiàn)狀
    1.2 查爾酮異構(gòu)酶研究進(jìn)展
        1.2.1 查爾酮異構(gòu)酶的類型特點(diǎn)及催化過(guò)程
        1.2.2 查爾酮異構(gòu)酶基因研究進(jìn)展
        1.2.3 查爾酮異構(gòu)酶基因在基因工程中的應(yīng)用
    1.3 查爾酮合成酶研究進(jìn)展
        1.3.1 查爾酮合成酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制
        1.3.2 查爾酮合成酶基因研究進(jìn)展
        1.3.3 查爾酮合成酶基因的功能及應(yīng)用
    1.4 獲得目的基因的常用方法概述
    1.5 轉(zhuǎn)基因大豆研究方法概述
    1.6 本實(shí)驗(yàn)研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株及質(zhì)粒
        2.1.3 藥品
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 主要儀器設(shè)備
    2.2 方法
        2.2.1 綠豆葉片cDNA第一鏈的獲得
        2.2.2 綠豆查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆
            2.2.2.1 綠豆CHI基因片段的克隆
            2.2.2.2 綠豆CHI基因片段的回收、連接及轉(zhuǎn)化
            2.2.2.3 綠豆CHI基因的拼接及驗(yàn)證
        2.2.3 綠豆查爾酮合成酶基因的克隆
            2.2.3.1 綠豆CHS的獲得
            2.2.3.2 綠豆CH8基因的回收、連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序
            2.2.3.3 綠豆CHS基因的驗(yàn)證
        2.2.4 植物表達(dá)載體pFGC5941-CHI的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
        2.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性植株的獲得及分子檢測(cè)
        2.2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大豆及陽(yáng)性植株的分子檢測(cè)
3 結(jié)果與分析
    3.1 綠豆查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆
        3.1.1 綠豆RNA的提取與檢測(cè)
        3.1.2 綠豆CHI基因片段的獲得
        3.1.3 綠豆CHI基因片段的測(cè)序結(jié)果分析
        3.1.4 綠豆CHI基因的拼接結(jié)果與驗(yàn)證
        3.1.5 綠豆CHI基因的獲得與生物信息學(xué)分析
    3.2 綠豆查爾酮合成酶基因的克隆
        3.2.1 綠豆CHS基因的獲得
        3.2.2 綠豆CHS基因的驗(yàn)證
        3.2.3 綠豆CHS基因的生物信息學(xué)分析
    3.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
        3.3.1 植物表達(dá)載體pFGC5941-CHI的構(gòu)建
        3.3.2 重組載體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證
    3.4 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草
        3.4.1 重組載體的煙草遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程
        3.4.2 轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性植株分子檢測(cè)
            3.4.2.1 轉(zhuǎn)基因煙草PCR檢測(cè)
            3.4.2.2 轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性植株的RT-PCR檢測(cè)
            3.4.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性植株的總黃酮含量檢測(cè)
    3.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大豆
        3.5.1 種胚侵染轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大豆
        3.5.2 轉(zhuǎn)基因大豆陽(yáng)性植株的檢測(cè)
            3.5.2.1 轉(zhuǎn)基因大豆植株P(guān)CR檢測(cè)
            3.5.2.2 轉(zhuǎn)基因大豆陽(yáng)性植株RT-PCR檢測(cè)
            3.5.2.3 轉(zhuǎn)基因大豆陽(yáng)性植株的抗除草劑檢測(cè)
            3.5.2.4 轉(zhuǎn)基因大豆陽(yáng)性植株葉片總黃酮含量檢測(cè)
4 討論
    4.1 綠豆查爾酮異構(gòu)酶基因與查爾酮合成酶基因的克隆
    4.2 綠豆查爾酮異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化煙草
    4.3 綠豆查爾酮異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化大豆
    4.4 本文創(chuàng)新點(diǎn)
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ 培養(yǎng)基配方
附錄Ⅱ pFGC5941載體圖譜
附錄Ⅲ 綠豆查爾酮異構(gòu)酶與查爾酮合成酶基因及氨基酸序列
附錄Ⅳ 藥品縮略詞
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]中國(guó)綠豆核心種質(zhì)資源在不同環(huán)境下的表型變異及生態(tài)適應(yīng)性評(píng)價(jià)[J]. 王麗俠,程須珍,王素華,朱旭,劉振興.  作物學(xué)報(bào). 2014(04)
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[4]農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)非組織培養(yǎng)遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化[J]. 李丹丹,張潔,劉娜,陳琰,韓勝芳,王冬梅.  植物遺傳資源學(xué)報(bào). 2012(05)
[5]大豆遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展[J]. 孫炳君.  科協(xié)論壇(下半月). 2012(08)
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博士論文
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碩士論文
[1]綠豆胰蛋白酶抑制劑活性片段的表達(dá)純化及生物學(xué)活性研究[D]. 趙亞蕊.山西大學(xué) 2012
[2]3α-HSD/CR、aiiA和3α-HSD/CR-aiik基因轉(zhuǎn)化煙草及表達(dá)分析[D]. 營(yíng)文文.福建農(nóng)林大學(xué) 2012
[3]綠豆中抗菌肽的分離純化與表征及其晶體培養(yǎng)[D]. 吳金鴻.福州大學(xué) 2004



本文編號(hào)：3153607