過(guò)量表達(dá)擬南芥EDT1基因?qū)μ岣哂衩啄秃敌缘难芯?/H1>

發(fā)布時(shí)間：2017-04-18 08:16

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【摘要】：隨著全球經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展,人口總數(shù)持續(xù)增加,對(duì)環(huán)境的影響愈來(lái)愈烈,種種原因都加快了土地荒漠化,其中干旱缺水現(xiàn)象逐年加劇,嚴(yán)重影響著各類作物的生長(zhǎng)發(fā)育。全球干旱、半干旱的土地面積在全球土地資源中占據(jù)很大的比重,為了滿足人們的需求,每年絕大多數(shù)玉米不得不被種植于這樣貧瘠的土地上,勢(shì)必會(huì)造成玉米產(chǎn)量較低的局面。培育耐旱性玉米已經(jīng)成為重要的育種焦點(diǎn)和趨勢(shì)�，F(xiàn)代生物育種技術(shù)的興起,無(wú)疑對(duì)改善、提高玉米產(chǎn)量帶來(lái)了福音,特別是轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)在近年來(lái)的興起、應(yīng)用,達(dá)到迅猛發(fā)展的階段,已有大量相關(guān)的研究報(bào)道。將外源耐旱性基因轉(zhuǎn)入玉米組織,經(jīng)過(guò)一定的篩選培育,從而獲得較為理想的耐旱性玉米品種,是解決玉米產(chǎn)量低的有效方式。AtEDTl基因來(lái)源于擬南芥,其編碼的蛋白由722個(gè)氨基酸組成,屬于植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族-同源異型亮氨酸拉鏈第1V家族。已有研究證實(shí),EDT1轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)植物耐旱性相關(guān)基因的表達(dá),從而提高作物的耐旱性,最初在煙草中證實(shí)了這一功能,后來(lái)在水稻中不僅驗(yàn)證了該耐旱性功能,同時(shí)還證實(shí)該基因的存在可以提高水稻的產(chǎn)量。在其他植物中也有驗(yàn)證,但目前在玉米中還未得到相關(guān)功能驗(yàn)證的報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)就是采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建好的pCB2004-EDT1表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到玉米的愈傷組織及莖尖組織中,對(duì)獲得的抗性植株進(jìn)行PCR和qRT-PCR的檢測(cè),確定陽(yáng)性植株。加代獲得高代陽(yáng)性植株,并測(cè)定其產(chǎn)量性狀。通過(guò)PEG-6000干旱脅迫模擬實(shí)驗(yàn),測(cè)定耐旱相關(guān)的生理生化指標(biāo)。經(jīng)過(guò)一系列研究,驗(yàn)證該基因?qū)μ岣哂衩啄秃敌缘墓δ?也為培育耐旱性的玉米提供了重要的材料。本研究獲得結(jié)果如下：(1)遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株的獲得通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,侵染600粒愈傷組織顆粒和1500個(gè)莖尖組織,經(jīng)Basta除草劑篩選,分別獲得10株和389株抗性轉(zhuǎn)化植株,移栽大田后分別成活2株愈傷再生植株和291株莖尖再生植株。(2)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株及后代株系的獲得通過(guò)PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因T0代目的基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增并測(cè)序,分別獲得1株愈傷組織陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株和20株莖尖組織陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株。對(duì)陽(yáng)性T0代進(jìn)行自交獲得T1代植株,經(jīng)PCR檢測(cè)分別獲得4株和20株T1代陽(yáng)性植株。4株愈傷陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株來(lái)自于1個(gè)T0代陽(yáng)性植株(T0代編號(hào)為04-2)。進(jìn)一步選取PCR穩(wěn)定的12株T1陽(yáng)性莖尖轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行自交加代兩次,獲得65株T3代陽(yáng)性植株,其中34株更為確定。經(jīng)陽(yáng)性追溯統(tǒng)計(jì),34株莖尖陽(yáng)性植株分別屬于4個(gè)轉(zhuǎn)化事件(T0代田間編號(hào)分別為43、283、314及284),其中19株來(lái)自于編號(hào)43(T2代陽(yáng)性田間編號(hào)為1-22),15株來(lái)自于編號(hào)283(T2代陽(yáng)性田間編號(hào)為5-224-9),編號(hào)284和314株系(T2代陽(yáng)性田間編號(hào)分別為9-9和8-13)均獲得14株T3代陽(yáng)性植株。(3)目的基因表達(dá)情況提取14株T3代莖尖組織陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株葉片的總RNA,利用qRT-PCR相對(duì)定量檢測(cè)目的基因在不同轉(zhuǎn)化事件中的表達(dá)情況,整理數(shù)據(jù)后進(jìn)行方差分析,結(jié)果表明,相比于空白對(duì)照18-599W,5個(gè)T2代轉(zhuǎn)化株系內(nèi)基因的表達(dá)量均顯著性增加,其中,5-22和9-9的表達(dá)量約為空白對(duì)照的30倍以上。(4)產(chǎn)量性狀的測(cè)定測(cè)定T3代5個(gè)莖尖轉(zhuǎn)化植株株系陽(yáng)性植株的穗長(zhǎng)、禿尖長(zhǎng)、穗粗、穗行數(shù)、行粒數(shù)、穗重和百粒重。通過(guò)軟件JMP 10對(duì)各性狀進(jìn)行顯著性分析,結(jié)果表明1-22株系的百粒重顯著高于對(duì)照18-599W。但其他各個(gè)株系中的其他性狀均未表現(xiàn)出顯著性的差異。(5)耐旱相關(guān)性狀鑒定通過(guò)PEG-6000模擬干旱脅迫實(shí)驗(yàn)測(cè)定T3代陽(yáng)性植株的耐旱相關(guān)性狀。經(jīng)方差分析,正常培養(yǎng)和脅迫處理的兩種環(huán)境下, 18-599W的各項(xiàng)指標(biāo)前后均沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性提高,但編號(hào)9-9陽(yáng)性株系的葉綠素含量、1-22的根系干重、5-22的根冠比是呈顯著增加的。干旱脅迫下陽(yáng)性株系5-22、9-9、1-22的根系相比于非脅迫下陽(yáng)性株系的根系更為發(fā)達(dá)。脅迫處理下,相比于對(duì)照18-599W,9-9轉(zhuǎn)化株系的葉綠素含量和根系干重顯著增加,5-22的根冠比及根系干重顯著性增加,1-22的根系干重同樣是顯著性增加的,但其他根系掃描所測(cè)得根系數(shù)據(jù)并沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性差異。
【關(guān)鍵詞】：AtEDT1 轉(zhuǎn)基因 玉米 耐旱性
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S513
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 研究背景12-24
• 1.1 植物耐旱性的研究概況12-19
• 1.1.1 干旱的狀況及其對(duì)植物的影響12-13
• 1.1.2 耐旱性轉(zhuǎn)基因玉米的研究概況13-14
• 1.1.3 植物耐旱性機(jī)制14-15
• 1.1.4 植物耐旱性鑒定指標(biāo)15-17
• 1.1.4.1 形態(tài)和產(chǎn)量指標(biāo)15
• 1.1.4.2 生理指標(biāo)15-16
• 1.1.4.3 生化指標(biāo)16-17
• 1.1.5 PEG模擬干旱脅迫的研究進(jìn)展17-19
• 1.1.5.1 PEG簡(jiǎn)介17-18
• 1.1.5.2 PEG模擬干旱脅迫的研究進(jìn)展18-19
• 1.2 同源異型域-亮氨酸拉鏈蛋白(Homedomain-leucine Zipper,HD-ZIP)基因家族的研究現(xiàn)狀19-21
• 1.2.1 HD-ZIP蛋白的結(jié)構(gòu)與分類19
• 1.2.2 HD-Zip Ⅳ類轉(zhuǎn)錄因子的功能研究19-21
• 1.3 AtEDT1基因的研究進(jìn)展21-23
• 1.3.1 AtEDT1基因的來(lái)源及結(jié)構(gòu)功能研究21-22
• 1.3.2 AtEDT1基因的應(yīng)用22-23
• 1.4 轉(zhuǎn)基因玉米的轉(zhuǎn)化受體及技術(shù)23-24
• 1.4.1 轉(zhuǎn)基因玉米的轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)23-24
• 1.4.2 轉(zhuǎn)基因玉米的轉(zhuǎn)化技術(shù)24
• 2 本研究的目的意義24-25
• 3 材料與方法25-41
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料25-28
• 3.1.1 植物材料25
• 3.1.2 菌株及載體25
• 3.1.3 主要試劑及試劑盒25-26
• 3.1.4 常用基本溶液26
• 3.1.5 培養(yǎng)基26-27
• 3.1.6 實(shí)驗(yàn)儀器27-28
• 3.2 技術(shù)路線28
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法28-31
• 3.3.1 擴(kuò)繁表達(dá)載體質(zhì)粒pCB2004-EDT128-29
• 3.3.2 質(zhì)粒提取29-30
• 3.3.3 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備30-31
• 3.3.4 表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌31
• 3.4 玉米的遺傳轉(zhuǎn)化31-35
• 3.4.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化31-33
• 3.4.1.1 玉米愈傷組織的培養(yǎng)31-32
• 3.4.1.2 玉米愈傷組織侵染及共培養(yǎng)32
• 3.4.1.3 清洗侵染的玉米愈傷組織32
• 3.4.1.4 玉米愈傷組織的恢復(fù)及篩選培養(yǎng)32
• 3.4.1.5 玉米愈傷組織的分化培養(yǎng)32-33
• 3.4.1.6 再生苗的煉苗、移栽及定植33
• 3.4.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米莖尖組織遺傳轉(zhuǎn)化33-35
• 3.4.2.1 玉米種子的滅菌33-34
• 3.4.2.2 玉米莖尖組織的侵染34
• 3.4.2.3 再生苗的移栽34
• 3.4.2.4 再生苗的篩選與定植34-35
• 3.5 T_0轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)35-36
• 3.5.1 T_0代植株總DNA的提取35
• 3.5.2 T_0代轉(zhuǎn)化植株DNA的PCR檢測(cè)35-36
• 3.5.3 高代轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)36
• 3.6 轉(zhuǎn)化莖尖組織的T_3代陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株基因的表達(dá)量分析36-39
• 3.6.1 模板cDNA制備36-39
• 3.6.1.1 總RNA的提取36-37
• 3.6.1.2 總RNA的反轉(zhuǎn)錄37-38
• 3.6.1.3 cDNA的效果檢測(cè)38-39
• 3.6.2 T_3代植株目的基因AtEDT1的表達(dá)量分析39
• 3.7 轉(zhuǎn)化莖尖組織的T_3代轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀的測(cè)定39
• 3.8 T_3代莖尖組織轉(zhuǎn)基因植株的PEG-6000模擬干旱脅迫實(shí)驗(yàn)39-41
• 3.8.1 材料39-40
• 3.8.2 實(shí)驗(yàn)方法40-41
• 3.8.2.1 實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)40
• 3.8.2.2 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株的確定40-41
• 3.8.2.3 15%PEG-6000模擬干旱脅迫處理41
• 4 結(jié)果與分析41-56
• 4.1 擴(kuò)繁表達(dá)載體pCB2004-EDT141-42
• 4.2 表達(dá)載體質(zhì)粒pCB2004-EDT1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌液42-43
• 4.3 AtEDT1基因的遺傳轉(zhuǎn)化43-49
• 4.3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化43-45
• 4.3.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米莖尖組織遺傳轉(zhuǎn)化45-49
• 4.4 T_3代莖尖組織陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株AtEDT1基因的表達(dá)量分析49-51
• 4.4.1 cDNA的制備49-50
• 4.4.2 目的基因AtEDT1的表達(dá)量分析50-51
• 4.5 T_3代莖尖組織轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀的測(cè)定51-52
• 4.6 T_3代莖尖組織轉(zhuǎn)基因植株的PEG-6000模擬干旱脅迫實(shí)驗(yàn)52-56
• 4.6.1 陽(yáng)性植株的確定52-53
• 4.6.2 葉綠素含量53-54
• 4.6.3 生物量54-56
• 4.6.4 根系掃描56
• 5 討論56-60
• 6 進(jìn)一步研究計(jì)劃60-61
• 參考文獻(xiàn)61-68
• 致謝68-69

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本文編號(hào)：314457

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