布魯氏菌病（brucellosis）是一種波及世界的重要的人畜共患病,對畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失,因為它人畜共患病的特點,也使其成為了人類健康和社會安全的一大威脅。然而,迄今為止,都未能研發(fā)出安全有效的疫苗。布魯氏菌（Brucella）,又稱作布氏桿菌,是造成布魯氏菌病的病原體,要研發(fā)出安全有效的疫苗,對該菌各類基因的功能研究是十分重要的。目前,對布魯氏菌基因的功能研究存在許多困難。一是布魯氏菌生長緩慢,在實驗室穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境下,菌體需要生長36-48h才能在平板上長出肉眼可見的菌落。初次分離的野生菌株生長往往更加緩慢。二是布魯氏菌病人畜共患的特征,使得對布魯氏菌的操作變的相當(dāng)繁瑣和耗時。這些因素都使得對布魯氏菌基因的研究變得格外困難。目前,對布魯氏菌基因功能的研究主要是依靠自殺質(zhì)粒,通過單交換和雙交換建立基因缺失株,再通過對基因缺失株的研究探索基因功能。但是,該方法耗時長,操作量大,大大增加了科研人員的操作風(fēng)險,同時也減緩了研究進度。所以,在布魯氏菌中創(chuàng)建一類迅速、精準(zhǔn)、有效的基因研究方式是具備重要意義的。CRISPRi與CRISPR/Cas9系統(tǒng),是近年發(fā)展迅速的領(lǐng)先的基因研究方... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

布魯氏菌侵染巨噬細胞模型

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017 屆碩士研究生學(xué)位論文長度一般在300到500bp之間。前導(dǎo)序列因為包含轉(zhuǎn)錄的起始位點，一般會作為CRISPR序列的啟動子發(fā)揮作用。重復(fù)序列的長度一般在23bp到55bp之間，其序列的兩端存在對稱結(jié)構(gòu)，這意味著，該序列轉(zhuǎn)錄出的RNA可能會具有類似發(fā)夾的結(jié)構(gòu)。該構(gòu)造能夠確保它順利與有關(guān)的Cas蛋白結(jié)合，形成核蛋白復(fù)合體，發(fā)揮生物學(xué)功能(Kuzminov 2001; Hsu et al 2013)。間隔序列的長度一般在21bp到72bp之間，值得一提的是，間隔序列原本并非細菌自身基因組的一部分，而是來自于侵染細菌的噬菌體、質(zhì)粒等外源DNA。這些被整合到基因組中的間隔序列，能夠讓細菌識別并免疫相同外源DNA的再次入侵(李輝和施振旦 2013)。Cas基因位于CRISPR基因的附近，Half和Makarova等科學(xué)家通過生物信息學(xué)等方式，對Cas基因做出了深入的研究，并且發(fā)現(xiàn)，Cas蛋白具有多種生物學(xué)功能，其結(jié)構(gòu)中含有核酸酶、解旋酶、聚合酶和與轉(zhuǎn)錄調(diào)控等相關(guān)的多種結(jié)構(gòu)域(Makarova et al2006)。

布魯氏菌中 CRISPRi 與 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的構(gòu)建及功能驗證CASCAD復(fù)合物中，crRNA具有識別外源DNA片段的能力，使整個復(fù)合物附著在外源DNA上，隨后由Cas3蛋白進行切割。因此，可以說Cas3蛋白是Type I類CRISPR/Cas系統(tǒng)干擾階段中最重要的蛋白。TypeII類別CRISPR/Cas系統(tǒng)的構(gòu)造在3種CRISPR/Cas系統(tǒng)中是最單一的。該系統(tǒng)具有4種Cas蛋白，分別為Cas1、Cas2、Cas9、Csn2或Cas4（TypeII-A或TypeII-B亞型）。在這之中，Cas9蛋白是TypeII類別CRISPR/Cas系統(tǒng)特有的蛋白。Cas9蛋白分子量很大，具有多種功能，不僅能參與pre-crRNA的成熟加工，也能起到核酸酶的功能，對外源DNA進行切割(Garneau et al 2010)。TypeIII類別的CRISPR/Cas系統(tǒng)獨有蛋白為Cas10蛋白，該蛋白同樣具有加工pre-crRNA和沉默外源DNA的功能。TypeIII型CRISPR/Cas系統(tǒng)又分為TypeIII-A和TypeIII-B兩種亞型，有研究證明，這兩種亞型的CRISPR/Cas系統(tǒng)的主要區(qū)別在于作用的靶標(biāo)，其中，TypeIII-A型作用于mRNA，而TypeIII-B型作用于DNA(Marraffini and Sontheimer 2008; Hale et al 2009)。

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3139574