本文關鍵詞：牦牛AQPs對高原腦水腫抗性的分子機理，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：『目的』缺氧是許多重大疾病尤其是腦疾病發(fā)生發(fā)展的主要誘因之一,而高原低氧又一直困擾著青藏高原各種資源的探索、開發(fā)及應用。由于青藏高原極端生境的特殊性及低海拔物種的自身適應性,導致快速進入青藏高原的低海拔動物腦的代謝極易發(fā)生紊亂而形成高原腦水腫。然而,到目前為止,人類對青藏高原動物腦水和能量代謝的調控機制及其對高原腦水腫的抗性機制尚且未知。牦牛(Bos grunniens)作為唯一適應青藏高原極端低氧環(huán)境的大型哺乳動物,在其高原畜牧生產和高原適應研究中占有極其重要的地位。水通道蛋白(AQPs)中AQP4與AQP9是哺乳動物腦中表達最豐富的分子之一；其不僅在腦細胞水和能量代謝的運輸中發(fā)揮著核心作用,而且在腦水腫病理生理過程中也發(fā)揮著關鍵的調控作用。因此,本論文以青藏高原牦牛為天然“低氧適應模型”,以低海拔黃牛為對照,初步探討了青藏高原動物AQPs對高原腦水腫抗性的分子機理。『方法』1)基因克隆技術；2)生物信息學方法；3)實時熒光定量PCR技術；4)免疫組化方法：5)運用國內外文獻數(shù)據(jù)庫(如PubMed、CNKI、Google)等網絡資源及相關生物信息學軟件,并結合高通量差異表達實驗驗證,構建了“牦牛AQP4相關高原腦水腫抗性的基因調控網絡”模型。『結果』(1)牦牛AQP4基因編碼區(qū)結構：起始密碼子為ATG,終止密碼子為TGA,序列長度為966 bp,編碼323個氨基酸,基因登錄號為KM609432；牦牛AQP9基因編碼區(qū)結構：起始密碼子為ATG,終止密碼子為TAA,序列長度為885 bp,編碼295個氨基酸,基因登錄號為KM820838。(2)成功構建了牦牛AQP4和AQP9全長CDS編碼序列的真核細胞熒光表達質粒pEGFP-AQP4和pEGFP-AQP9。(3)牦牛和黃牛AQP4和AQP9生物信息學特征比對：牦牛與黃牛AQP4和AQP9氨基酸序列的同源性分別為99.8%和99.3%；牦牛和黃牛的AQP4間存在1個氨基酸的差異,即牦牛的為絲氨酸(S),而黃牛的為丙氨酸(A)；牦牛和黃牛的AQP9間存在2個氨基酸的差異,即在第9位上牦牛的為酸性氨基酸谷氨酸(E)而黃牛的為堿性氨基酸賴氨酸(K),在第273位置上牦牛的為亮氨酸(L)而黃牛的為脯氨酸(P)；牦牛和黃牛的AQP4和AQP9兩種蛋白均由α-螺旋、延伸、β-折疊以及無規(guī)則卷曲4種結構組成,但該4種結構的組成及分布特征是不盡相同的,尤其是牦牛AQP4和AQP9胞質尾區(qū)a-螺旋結構均較黃牛的多；牦牛與黃牛AQP4和AQP9的蛋白均由相同數(shù)量氨基酸組成的6個跨膜區(qū)域構成；黃牛與牦牛AQP9的氨基酸序列均含有5個相同的磷酸化位點,即2個Ser磷酸化位點、1個Thr磷酸化位點及2個Tyr磷酸化位點；牦牛AQP4蛋白的疏水性除了第82號位氨基酸結構區(qū)域較黃牛的弱外其他區(qū)域的均相同,牦牛AQP9蛋白的疏水性除了第9和273號位氨基酸區(qū)域較黃牛的強外其他區(qū)域的均相同。(4)牦牛和黃牛的大腦皮質(扣帶回)、海馬、小腦和延髓中均有AQP4和AQP9 mRNA的表達,但其在上述物種間的表達水平是不盡相同的,即牦牛上述各功能區(qū)中該兩個基因mRNA的表達水平均極顯著地低于黃牛的(P0.001)。(5)牦牛和黃牛大腦皮質(扣帶回)、海馬、小腦和延髓中AQP9的分布特征基本與黃牛的均相似；且其在上述不同功能區(qū)中陽性反應產物表達的面積(S)和累計光密度(IOD)值的變化趨勢均為SmedullaScortexScerebellumShippocampal和 IODmedullaIODcortex IODcerebellumIODhippocanpal;但是,牦牛上述各功能區(qū)AQP9陽性反應產物表達的S和IOD值均極顯著地低于黃牛的(P0.01)。(6)AQPs主要與HIF-1、TNF、MAPK、VSMCNF-kβ、CAMs和cGMP-PKG七個信號通路相關聯(lián)參與了“低氧缺血性腦水腫的基因調控網絡”；在參與低氧缺血性腦水腫基因調控網絡的16個必要因子中,在牦牛和黃牛大腦皮質中差異極顯著表達的因子有ET-1、HIF-1α、NFAT5、NOS、MMP9、AQP4、AQP9、 GST、p38和、VEGF共計10個�！航Y論』(1)克隆得到的牦牛AQP4基因編碼區(qū)序列具有特異的起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA),長度為966bp的開放閱讀框,編碼323個氨基酸,獲得基因登錄號為KM609432；克隆得到的牦牛AQP9基因編碼區(qū)含有一個長度為885bp的開放閱讀框,編碼295個氨基酸,起始密碼子為ATG,終止密碼子為TAA,獲得基因登錄號為KM820838。(2)通過生物信息學特征分析表明,盡管牦牛AQP4和AQP9的氨基酸序列與低海拔物種黃牛的相比較均具有極高的進化保守性,但在青藏高原極端低氧生境的長期脅迫下,這兩個與腦水腫發(fā)生密切相關的關鍵通道蛋白在一級結構(氨基酸序列)、二級結構(疏水性)及三級結構(胞質尾區(qū)a螺旋的分布)中均發(fā)生了重要的突變,其特殊的生物信息學特征導致該“關鍵通道蛋白”均具有對氧較強的敏感性及其對其他因子較強的作用系數(shù)等功能,進而不僅在高原腦水腫的抗性中發(fā)揮著關鍵的調控作用,而且還在極端低氧生境中為牦牛腦細胞提供著充足的能量代謝底物。(3)在青藏高原極端低氧生境中,牦牛腦AQP4和AQP9以極低的表達通過減少對水的轉運而在高原腦水腫的抗性中發(fā)揮著重要作用。(4)牦牛腦在青藏高原極端低氧應激下,在其對高原腦水腫抗性的基因調控網絡中,AQP4、AQP9、HIF-1α、MMP9、NFAT5、NOS、ET-1、p38、GST和VEGF10個必要因子可能為參與“牦牛腦對高原腦水腫抗性基因調控網絡”的關鍵候選基因,而其中GST和VEGF的作用還待進一步確定。但上述10關鍵候選基因具體參與牦牛腦水腫抗性的調控機制均有待進一步深究。
【關鍵詞】：牦牛 腦 高原低氧適應 高原腦水腫 水通道蛋白-4 水通道蛋白-9 基因調控網絡
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S823.85;Q494
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-12
• 第一章 緒論12-21
• 1.1 腦水通道蛋白研究進展12-17
• 1.1.1 概述12
• 1.1.2 AQPs的發(fā)現(xiàn)12
• 1.1.3 AQPs的結構12-13
• 1.1.4 腦AQPs的定位及表達13
• 1.1.5 腦AQPs的功能13-15
• 1.1.6 腦AQP的調節(jié)機制15-17
• 1.2 高原腦水腫17-18
• 1.2.1 腦水腫的定義與分類17-18
• 1.2.2 高原腦水腫及病理特征18
• 1.2.3 高原腦水腫的發(fā)病機制18
• 1.3 AQPs在腦水腫形成及消除過程中的作用機制18-19
• 1.4 基因調控網絡19-20
• 1.5 小結20-21
• 第二章 實驗材料與方法21-33
• 2.1 材料21-24
• 2.1.1 試驗動物21
• 2.1.2 載體與菌株21-22
• 2.1.3 實驗主要試劑22
• 2.1.4 抗體22-23
• 2.1.5 緩沖液和溶液配方23-24
• 2.1.6 實驗儀器24
• 2.2 方法24-33
• 2.2.1 牦牛AQP4和AQP9基因CDS區(qū)克隆24-27
• 2.2.2 生物信息學分析27
• 2.2.3 牦牛AQP4和AQP9基因真核表達載體構建27-28
• 2.2.4 Real-Time Quantitative RCR28-29
• 2.2.5 石蠟切片與免疫組化29-30
• 2.2.6 AQPs和低氧缺血性腦水腫基因調控網絡模型30-32
• 2.2.7 通過RT-PCR對模型驗證分析32-33
• 第三章 實驗結果33-55
• 3.1 牦牛AQP4和AQP9基因CDS區(qū)克隆33-37
• 3.1.1 牦牛腦組織總RNA提取33
• 3.1.2 牦牛AQP4和AQP9基因的擴增33-34
• 3.1.3 牦牛AQP4和AQP9基因的序列測定及分析34-37
• 3.2 AQP4和AQP9基因編碼蛋白結構37-42
• 3.2.1 蛋白質氨基酸序列分析37-38
• 3.2.2 蛋白高級結構38-39
• 3.2.3 基因編碼蛋白功能預測39-42
• 3.3 牦牛AQP4和AQP9基因真核表達載體的構建42-43
• 3.3.1 牦牛AQP4和AQP9基因的獲取42-43
• 3.3.2 重組子鑒定43
• 3.4 AQPs基因在腦組織中的表達43-50
• 3.4.1 AQPs mRNA在腦組織中的表達43-45
• 3.4.2 不同功能腦區(qū)AQP9蛋白表達的定位和定量分析45-50
• 3.5 低氧缺血性腦水腫基因調控網絡模型50-54
• 3.5.1 數(shù)據(jù)庫相關因子搜索結果50
• 3.5.2 數(shù)據(jù)庫分子統(tǒng)計結果50-51
• 3.5.3 數(shù)據(jù)庫分子間相關性分析51-52
• 3.5.4 AQP4與低氧缺血性腦水腫基因調控網絡52
• 3.5.5 AQP4相關低氧缺血性腦水腫基因調控網絡模型52-54
• 3.6 AQP4相關低氧缺血性腦水腫調控網絡模型的驗證54-55
• 第四章 討論55-61
• 4.1 在生物信息學特征方面55-57
• 4.2 在表達特征方面57
• 4.3 在基因調控網絡方面57-61
• 第五章 結論61-62
• 參考文獻62-78
• 附錄78-79
• 作者簡歷79-80
• 在學期間的研究成果80-81
• 致謝81

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本文編號：308879