本文關(guān)鍵詞：牦牛AQPs對(duì)高原腦水腫抗性的分子機(jī)理，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：『目的』缺氧是許多重大疾病尤其是腦疾病發(fā)生發(fā)展的主要誘因之一,而高原低氧又一直困擾著青藏高原各種資源的探索、開發(fā)及應(yīng)用。由于青藏高原極端生境的特殊性及低海拔物種的自身適應(yīng)性,導(dǎo)致快速進(jìn)入青藏高原的低海拔動(dòng)物腦的代謝極易發(fā)生紊亂而形成高原腦水腫。然而,到目前為止,人類對(duì)青藏高原動(dòng)物腦水和能量代謝的調(diào)控機(jī)制及其對(duì)高原腦水腫的抗性機(jī)制尚且未知。牦牛(Bos grunniens)作為唯一適應(yīng)青藏高原極端低氧環(huán)境的大型哺乳動(dòng)物,在其高原畜牧生產(chǎn)和高原適應(yīng)研究中占有極其重要的地位。水通道蛋白(AQPs)中AQP4與AQP9是哺乳動(dòng)物腦中表達(dá)最豐富的分子之一；其不僅在腦細(xì)胞水和能量代謝的運(yùn)輸中發(fā)揮著核心作用,而且在腦水腫病理生理過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。因此,本論文以青藏高原牦牛為天然“低氧適應(yīng)模型”,以低海拔黃牛為對(duì)照,初步探討了青藏高原動(dòng)物AQPs對(duì)高原腦水腫抗性的分子機(jī)理�！悍椒ā�1)基因克隆技術(shù)；2)生物信息學(xué)方法；3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)；4)免疫組化方法：5)運(yùn)用國內(nèi)外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(如PubMed、CNKI、Google)等網(wǎng)絡(luò)資源及相關(guān)生物信息學(xué)軟件,并結(jié)合高通量差異表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,構(gòu)建了“牦牛AQP4相關(guān)高原腦水腫抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)”模型�！航Y(jié)果』(1)牦牛AQP4基因編碼區(qū)結(jié)構(gòu)：起始密碼子為ATG,終止密碼子為TGA,序列長度為966 bp,編碼323個(gè)氨基酸,基因登錄號(hào)為KM609432；牦牛AQP9基因編碼區(qū)結(jié)構(gòu)：起始密碼子為ATG,終止密碼子為TAA,序列長度為885 bp,編碼295個(gè)氨基酸,基因登錄號(hào)為KM820838。(2)成功構(gòu)建了牦牛AQP4和AQP9全長CDS編碼序列的真核細(xì)胞熒光表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-AQP4和pEGFP-AQP9。(3)牦牛和黃牛AQP4和AQP9生物信息學(xué)特征比對(duì)：牦牛與黃牛AQP4和AQP9氨基酸序列的同源性分別為99.8%和99.3%；牦牛和黃牛的AQP4間存在1個(gè)氨基酸的差異,即牦牛的為絲氨酸(S),而黃牛的為丙氨酸(A)；牦牛和黃牛的AQP9間存在2個(gè)氨基酸的差異,即在第9位上牦牛的為酸性氨基酸谷氨酸(E)而黃牛的為堿性氨基酸賴氨酸(K),在第273位置上牦牛的為亮氨酸(L)而黃牛的為脯氨酸(P)；牦牛和黃牛的AQP4和AQP9兩種蛋白均由α-螺旋、延伸、β-折疊以及無規(guī)則卷曲4種結(jié)構(gòu)組成,但該4種結(jié)構(gòu)的組成及分布特征是不盡相同的,尤其是牦牛AQP4和AQP9胞質(zhì)尾區(qū)a-螺旋結(jié)構(gòu)均較黃牛的多；牦牛與黃牛AQP4和AQP9的蛋白均由相同數(shù)量氨基酸組成的6個(gè)跨膜區(qū)域構(gòu)成；黃牛與牦牛AQP9的氨基酸序列均含有5個(gè)相同的磷酸化位點(diǎn),即2個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)及2個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)；牦牛AQP4蛋白的疏水性除了第82號(hào)位氨基酸結(jié)構(gòu)區(qū)域較黃牛的弱外其他區(qū)域的均相同,牦牛AQP9蛋白的疏水性除了第9和273號(hào)位氨基酸區(qū)域較黃牛的強(qiáng)外其他區(qū)域的均相同。(4)牦牛和黃牛的大腦皮質(zhì)(扣帶回)、海馬、小腦和延髓中均有AQP4和AQP9 mRNA的表達(dá),但其在上述物種間的表達(dá)水平是不盡相同的,即牦牛上述各功能區(qū)中該兩個(gè)基因mRNA的表達(dá)水平均極顯著地低于黃牛的(P0.001)。(5)牦牛和黃牛大腦皮質(zhì)(扣帶回)、海馬、小腦和延髓中AQP9的分布特征基本與黃牛的均相似；且其在上述不同功能區(qū)中陽性反應(yīng)產(chǎn)物表達(dá)的面積(S)和累計(jì)光密度(IOD)值的變化趨勢(shì)均為SmedullaScortexScerebellumShippocampal和 IODmedullaIODcortex IODcerebellumIODhippocanpal;但是,牦牛上述各功能區(qū)AQP9陽性反應(yīng)產(chǎn)物表達(dá)的S和IOD值均極顯著地低于黃牛的(P0.01)。(6)AQPs主要與HIF-1、TNF、MAPK、VSMCNF-kβ、CAMs和cGMP-PKG七個(gè)信號(hào)通路相關(guān)聯(lián)參與了“低氧缺血性腦水腫的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)”；在參與低氧缺血性腦水腫基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的16個(gè)必要因子中,在牦牛和黃牛大腦皮質(zhì)中差異極顯著表達(dá)的因子有ET-1、HIF-1α、NFAT5、NOS、MMP9、AQP4、AQP9、 GST、p38和、VEGF共計(jì)10個(gè)�！航Y(jié)論』(1)克隆得到的牦牛AQP4基因編碼區(qū)序列具有特異的起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA),長度為966bp的開放閱讀框,編碼323個(gè)氨基酸,獲得基因登錄號(hào)為KM609432；克隆得到的牦牛AQP9基因編碼區(qū)含有一個(gè)長度為885bp的開放閱讀框,編碼295個(gè)氨基酸,起始密碼子為ATG,終止密碼子為TAA,獲得基因登錄號(hào)為KM820838。(2)通過生物信息學(xué)特征分析表明,盡管牦牛AQP4和AQP9的氨基酸序列與低海拔物種黃牛的相比較均具有極高的進(jìn)化保守性,但在青藏高原極端低氧生境的長期脅迫下,這兩個(gè)與腦水腫發(fā)生密切相關(guān)的關(guān)鍵通道蛋白在一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)、二級(jí)結(jié)構(gòu)(疏水性)及三級(jí)結(jié)構(gòu)(胞質(zhì)尾區(qū)a螺旋的分布)中均發(fā)生了重要的突變,其特殊的生物信息學(xué)特征導(dǎo)致該“關(guān)鍵通道蛋白”均具有對(duì)氧較強(qiáng)的敏感性及其對(duì)其他因子較強(qiáng)的作用系數(shù)等功能,進(jìn)而不僅在高原腦水腫的抗性中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用,而且還在極端低氧生境中為牦牛腦細(xì)胞提供著充足的能量代謝底物。(3)在青藏高原極端低氧生境中,牦牛腦AQP4和AQP9以極低的表達(dá)通過減少對(duì)水的轉(zhuǎn)運(yùn)而在高原腦水腫的抗性中發(fā)揮著重要作用。(4)牦牛腦在青藏高原極端低氧應(yīng)激下,在其對(duì)高原腦水腫抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,AQP4、AQP9、HIF-1α、MMP9、NFAT5、NOS、ET-1、p38、GST和VEGF10個(gè)必要因子可能為參與“牦牛腦對(duì)高原腦水腫抗性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)”的關(guān)鍵候選基因,而其中GST和VEGF的作用還待進(jìn)一步確定。但上述10關(guān)鍵候選基因具體參與牦牛腦水腫抗性的調(diào)控機(jī)制均有待進(jìn)一步深究。
【關(guān)鍵詞】：牦牛 腦 高原低氧適應(yīng) 高原腦水腫 水通道蛋白-4 水通道蛋白-9 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S823.85;Q494
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-12
• 第一章 緒論12-21
• 1.1 腦水通道蛋白研究進(jìn)展12-17
• 1.1.1 概述12
• 1.1.2 AQPs的發(fā)現(xiàn)12
• 1.1.3 AQPs的結(jié)構(gòu)12-13
• 1.1.4 腦AQPs的定位及表達(dá)13
• 1.1.5 腦AQPs的功能13-15
• 1.1.6 腦AQP的調(diào)節(jié)機(jī)制15-17
• 1.2 高原腦水腫17-18
• 1.2.1 腦水腫的定義與分類17-18
• 1.2.2 高原腦水腫及病理特征18
• 1.2.3 高原腦水腫的發(fā)病機(jī)制18
• 1.3 AQPs在腦水腫形成及消除過程中的作用機(jī)制18-19
• 1.4 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)19-20
• 1.5 小結(jié)20-21
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法21-33
• 2.1 材料21-24
• 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物21
• 2.1.2 載體與菌株21-22
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑22
• 2.1.4 抗體22-23
• 2.1.5 緩沖液和溶液配方23-24
• 2.1.6 實(shí)驗(yàn)儀器24
• 2.2 方法24-33
• 2.2.1 牦牛AQP4和AQP9基因CDS區(qū)克隆24-27
• 2.2.2 生物信息學(xué)分析27
• 2.2.3 牦牛AQP4和AQP9基因真核表達(dá)載體構(gòu)建27-28
• 2.2.4 Real-Time Quantitative RCR28-29
• 2.2.5 石蠟切片與免疫組化29-30
• 2.2.6 AQPs和低氧缺血性腦水腫基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型30-32
• 2.2.7 通過RT-PCR對(duì)模型驗(yàn)證分析32-33
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-55
• 3.1 牦牛AQP4和AQP9基因CDS區(qū)克隆33-37
• 3.1.1 牦牛腦組織總RNA提取33
• 3.1.2 牦牛AQP4和AQP9基因的擴(kuò)增33-34
• 3.1.3 牦牛AQP4和AQP9基因的序列測定及分析34-37
• 3.2 AQP4和AQP9基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)37-42
• 3.2.1 蛋白質(zhì)氨基酸序列分析37-38
• 3.2.2 蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)38-39
• 3.2.3 基因編碼蛋白功能預(yù)測39-42
• 3.3 牦牛AQP4和AQP9基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建42-43
• 3.3.1 牦牛AQP4和AQP9基因的獲取42-43
• 3.3.2 重組子鑒定43
• 3.4 AQPs基因在腦組織中的表達(dá)43-50
• 3.4.1 AQPs mRNA在腦組織中的表達(dá)43-45
• 3.4.2 不同功能腦區(qū)AQP9蛋白表達(dá)的定位和定量分析45-50
• 3.5 低氧缺血性腦水腫基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型50-54
• 3.5.1 數(shù)據(jù)庫相關(guān)因子搜索結(jié)果50
• 3.5.2 數(shù)據(jù)庫分子統(tǒng)計(jì)結(jié)果50-51
• 3.5.3 數(shù)據(jù)庫分子間相關(guān)性分析51-52
• 3.5.4 AQP4與低氧缺血性腦水腫基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)52
• 3.5.5 AQP4相關(guān)低氧缺血性腦水腫基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型52-54
• 3.6 AQP4相關(guān)低氧缺血性腦水腫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型的驗(yàn)證54-55
• 第四章 討論55-61
• 4.1 在生物信息學(xué)特征方面55-57
• 4.2 在表達(dá)特征方面57
• 4.3 在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面57-61
• 第五章 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-78
• 附錄78-79
• 作者簡歷79-80
• 在學(xué)期間的研究成果80-81
• 致謝81

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本文編號(hào)：308879