大葉蛇葡萄（Ampelopsis megalophylla Diels et Gilg）又稱大葉山葡萄,是我國湖北省恩施地區(qū)一種具特色的藥用植物,其嫩葉及嫩莖的加工品在當(dāng)?shù)乇环Q為“霉茶”。目前大葉蛇葡萄的藥用資源主要來源于野生,不同來源的大葉蛇葡萄品質(zhì)存在著一定的差異。眾所周知,藥用植物資源品質(zhì)的優(yōu)劣與其積累的活性次生代謝產(chǎn)物有著直接關(guān)系。因此,為了從源頭控制其資源品質(zhì),需從分子生物學(xué)角度闡明活性成分的生物合成途徑。目前有關(guān)大葉蛇葡萄主要活性成分生物合成關(guān)鍵酶基因的克隆及功能鑒定研究未見報道。本論文基于課題組前期建立的大葉蛇葡萄的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,篩選了大葉蛇葡萄活性成分黃酮類化合物生物合成的關(guān)鍵基因,擬克隆編碼大葉蛇葡萄類黃酮-3’,5’-羥化酶（F3’,5’H）、無色花色素還原酶（LAR）、黃酮醇-3-羥化酶（F3H）的基因以及進(jìn)行關(guān)鍵基因F3’,5’H的功能鑒定,以期為大葉蛇葡萄活性成分生物合成分子機(jī)制的闡明,以及將來進(jìn)一步從基因組水平改良大葉蛇葡萄藥用植物資源品質(zhì)提供依據(jù)。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:（1）本論文在前期研究基礎(chǔ)上,以大葉蛇葡萄嫩葉為實驗材料,通過RT-PCR技術(shù)克隆了F... 

【文章來源】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)湖北省

【文章頁數(shù)】：131 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

大葉蛇葡萄葉片RNA凝膠電泳圖

湖北中醫(yī)藥大學(xué)2020屆碩士學(xué)位論文20圖1-2F3’,5’H基因全長克隆凝膠電泳圖Fig.1-2Full-lengthcloningofF3’,5’Hbygelelectrophoresis注：Marker為TransDNAMarker，F(xiàn)3’,5’H為F3’,5’H基因3.2.2大葉蛇葡萄F3’,5’H基因序列分析F3’,5’H基因序列經(jīng)BLAST搜索比對后發(fā)現(xiàn)與藤茶（Ampelopsisgrossedentata）的F3’,5’H相似性最高為99%；與葡萄（Vitisvinifera）的F3’,5’H相似性為93%~94%。將測序結(jié)果通過DNAMAN等軟件進(jìn)行基本的信息分析，得到大葉蛇葡萄F3’,5’H基因全長1931bp，其中包含一個長度為1527bp的開放閱讀框，編碼508個氨基酸殘基（圖1-3）。3.3大葉蛇葡萄F3’,5’H基因編碼蛋白生物信息學(xué)分析3.3.1F3’,5’H基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析利用ServerExPASy-ProtParamtool的在線軟件分析F3’,5’H基因編碼氨基酸的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其相對分子質(zhì)量為56.84KDa，等電點為8.50，分子式為C2549H4038N694O717S30，不穩(wěn)定指數(shù)為39.23，屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪族指數(shù)為92.17，總平均疏水性為-0.059小于0，為親水性蛋白。該蛋白含有508個氨基酸，其中亮氨酸（Leu）含量最高為11.4%，其次是丙氨酸（Ala）為8.5%，半胱氨酸（Cys）最低為0.8%。其中有53個負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp+Glu），56個正電荷氨基酸殘基

大葉蛇葡萄黃酮類成分生物合成關(guān)鍵基因的克隆及功能鑒定（Arg+Lys），表明大葉蛇葡萄 F3’,5’H 蛋白是親水性蛋白。利用 NCBIConcserved Domain 搜 索 后 發(fā) 現(xiàn) F3’,5’H 基 因 編 碼 的 蛋 白 屬 于 P450（Cytochrome P450）家族成員（圖 1-4）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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[2]大葉蛇葡萄不同器官黃酮類化合物代謝路徑差異表達(dá)基因研究[D]. 答國政.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 2017
[3]茶樹兒茶素在芽中積累規(guī)律及茶樹F3’5’H2的功能分析[D]. 王新珍.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[4]茶樹類黃酮-3’,5’-羥基化酶的功能分析[D]. 許玉嬌.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[5]大葉蛇葡萄黃酮提取物血清藥化及其對心、腎的保護(hù)作用研究[D]. 江燦.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 2013
[6]三種云南野生觀賞植物中類黃酮3’，5’羥基化酶基因的克隆及其表達(dá)分析[D]. 王翠麗.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[7]茶樹類黃酮3’，5’-羥基化酶的基因克隆與功能研究[D]. 陳嘯天.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[8]大葉蛇葡萄總黃酮提取物質(zhì)量分析及其降壓藥效學(xué)研究[D]. 楊若婧.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 2012
[9]新疆紫茉莉黃酮類化合物及色素的初步研究[D]. 李凌智.新疆大學(xué) 2010
[10]根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的F3’5’H基因?qū)栈ㄟz傳轉(zhuǎn)化的初步研究[D]. 徐建.西南大學(xué) 2007



本文編號：3061772