病原微生物的侵染導致的植物病害對農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量造成了巨大損失,促使人們不斷探索植物抗病信號傳導路徑。有抗病能力的植物受到病原微生物侵染時,許多局部反應如乙烯的快速釋放、各種防御基因的激活以及超敏反應（Hypersensitive responses,HR）等發(fā)揮著直接或間接作用。在這些反應發(fā)生之后,會進一步誘導未受侵染的植物部位表現(xiàn)出對多種病原體的持久抗性,即系統(tǒng)獲得性抗性（Systemic Acquired Resistance,SAR）。而植物內(nèi)源激素水楊酸（Salicylic acid,SA）是介導系統(tǒng)獲得性抗性的重要信號。SABP3（Salicylic Acid Binding Protein 3）是一種SA結(jié)合蛋白,屬于葉綠體碳酸酐酶（CA）,同時具有SA結(jié)合活性和CA酶活性,對于在病原體感染期間誘導宿主抗性至關(guān)重要。在本研究中,通過酵母文庫篩選得到了與SABP3互作的蛋白——S-腺苷甲硫氨酸合成酶2（S-adenosylmethionine synthases 2,SAM2/MAT2）。它是一種甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶,其催化甲硫氨酸產(chǎn)生S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

酵母雙雜交載體的構(gòu)建和驗證

擬南芥SABP3互作蛋白的鑒定及其介導的抗病機理解析26圖1酵母雙雜交載體的構(gòu)建和驗證Fig.1ConstructionofvectorpGADT7（A）片段的獲得。M，DL2000DNAMarker；1-4：由Col-0cDNA中擴增得到MAT2的cDNA片段。（A）Obtainingfragments.M,DL2000DNAMarker;1-4:ThefragmentofMAT2amplifiedfromCol-0cDNA.（B）pGADT7::MAT2的NdeI/EcoRI雙酶切驗證。M，DL5000DNAMarker；1-3：pGADT7::MAT2質(zhì)粒。（B）VerificationofpGADT7::MAT2byNdeI/EcoRIdoubledigestion.M,DL5000DNAMarker;1-3pGADT7::MATvector.然后將構(gòu)建好的AD載體和連接SABP3基因片段的BD載體通過酵母熱激轉(zhuǎn)化分別轉(zhuǎn)化到酵母菌中。經(jīng)過兩缺培養(yǎng)基（SD/-Leu/-Trp）的篩選后選取同時具有AD、BD載體的酵母單克隆菌落轉(zhuǎn)到四缺培養(yǎng)基（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）上繼續(xù)培養(yǎng)以檢測是否存在相互作用。觀察發(fā)現(xiàn)只有同時含有pGADT7::MAT2質(zhì)粒和pGBKT7::SABP3質(zhì)粒的酵母菌落能夠正常生長且變藍（圖2）。表明在酵母系統(tǒng)中SABP3能夠和MAT2發(fā)生互作，而不和其同源蛋白MAT1、MAT3和MAT4互作。圖2SABP3蛋白與MAT2互作Fig.2SABP3proteininteractionwithMAT2酵母雙雜交（Y2H）分析中SABP3能夠和MAT2互作�；プ黩炞C在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade上進行。InteractionbetweenSABP3andMAT2inyeasttwo-hybrid(Y2H)assays.TheinteractionwasvalidatedonSD/-Leu/-Trp/-His/-Ademedia.

山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文27在活體植物中，利用BIFC技術(shù)驗證SABP3和MAT2互作的真實性。首先構(gòu)建MAT2與N端YFP蛋白的瞬時表達載體pSPYNE-MAT2，以及SABP3與C端GFP蛋白的載體pSPYCE-SABP3。將構(gòu)建好的載體通過電激轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，配對后在煙草葉片上進行共表達。共聚焦顯微鏡下觀察的結(jié)果顯示，空pSPYNE載體與空pSPYCE載體共轉(zhuǎn)化到煙草中，未能檢測到綠色熒光蛋白（GFP）的熒光信號。而pSPYNE::MAT2和pSPYCE::SABP3在煙草中共表達后，在其下表皮細胞的細胞質(zhì)中能夠檢測到清晰的GFP熒光信號（圖3），這表明在植物體內(nèi)SABP3與MAT2發(fā)生相互作用。圖3BiFC證實SABP3和MAT2的相互作用Fig.3BiFCassayshowedtheinteractionbetweenSABP3andMAT2（A）pSPYNE::MAT2和pSPYCE::SABP3的質(zhì)粒PCR檢測。M，DL2000DNAMarker。（B）雙分子熒光互補（BiFC）實驗表明，SABP3和MAT2在細胞質(zhì)中共定位。侵染表達3天后，用共聚焦顯微鏡對GFP信號成像。這些實驗至少重復了3次，結(jié)果相似。圖片標尺=20μm。（A）PlasmidPCRdetectionofpSPYNE::MAT2andpSPYCE::SABP3.M，DL2000DNAMarker.（B）Bimolecularfluorescencecomplementation(BiFC)assaysshowco-localizationofSABP3andMAT2inthecytoplasm.ConfocalmicroscopywasusedtoimageGFPsignals3daysafterinfiltration.Theseexperimentswererepeatedatleastthreetimeswithsimilarresults.Imagescale=20μm.

【參考文獻】：
期刊論文
[1]乙烯介導的防衛(wèi)信號途徑研究進展[J]. 鄒驍剛.  安徽農(nóng)業(yè)科學. 2012(11)
[2]農(nóng)作物乙烯合成和信號轉(zhuǎn)導途徑及其對抗病反應的調(diào)控[J]. 翁宇,戴小楓.  分子植物育種. 2008(04)

博士論文
[1]銅離子激發(fā)擬南芥免疫機制的研究[D]. 張寶剛.山東農(nóng)業(yè)大學 2018



本文編號：3043726