柿（Diospyros kaki）主要分為甜柿和澀柿,其中澀柿需經(jīng)采后脫澀處理后方可食用。高濃度CO₂處理是最常用的澀柿采后脫澀處理技術(shù),主要是利用低氧環(huán)境促使果實(shí)進(jìn)行無(wú)氧呼吸增加乙醛含量,進(jìn)而與可溶性單寧縮合成不可溶聚合物,去除果實(shí)澀味。本實(shí)驗(yàn)以課題組前期采集并經(jīng)高濃度CO₂處理的‘鏡面柿’為材料,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,挖掘差異表達(dá)的乙醛代謝末端三個(gè)基因家族成員（丙酮酸激酶,PK;丙酮酸脫羧酶,PDC;乙醇脫氫酶,ADH）,獲得柿果實(shí)采后脫澀相關(guān)的新靶標(biāo)基因。主要結(jié)果如下:1.克隆了柿果實(shí)脫澀過(guò)程中乙醛代謝相關(guān)基因�；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的KEGG分析結(jié)果顯示,柿果實(shí)脫澀進(jìn)程中無(wú)氧呼吸相關(guān)的差異表達(dá)基因富集于糖酵解途徑,包括15個(gè)結(jié)構(gòu)基因,分別屬于ADH、PDC和PK家族。利用RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技術(shù)驗(yàn)證獲得12個(gè)基因（三個(gè)家族各有4個(gè)成員）,分析其核苷酸序列、氨基酸結(jié)構(gòu)以及進(jìn)化關(guān)系發(fā)現(xiàn),其中DkADH1（JX117841.1）、DkPDC1/2/3（JX117844.1-6.1）和DkPK1/... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

柿采后脫澀差異表達(dá)基因KEGG富集分析

浙江大學(xué)碩士畢業(yè)論文3結(jié)果與分析15圖3.2柿果實(shí)脫澀通路及乙醛代謝相關(guān)基因表達(dá)變化（a）糖酵解及丙酮酸代謝途徑示意圖；（b）乙醛代謝相關(guān)基因（ADH、PDC、PK）的表達(dá)模式[log2FC（FoldChange）]。每個(gè)基因的表達(dá)模式由2個(gè)網(wǎng)格表示，左為log2FC（CO2-1dvsCK-1d），右為log2FC（CO2+1-MCP-1dvsCK-1d），用0-9表示不同log2FC值。Figure3.2Expressionofacetaldehydemetabolismrelatedgenesduringpersimmonfruitdeastringency(a)Glycolysisandpyruvatemetabolismpathway;(b)ExpressionofDkADH/PDC/PK.Theexpressionpatternofeachgeneisrepresentedby2grids,log2FC(CO2-1dvsCK-1d)ontheleftandlog2FC(CO2+1-MCP-1dvsCK-1d)ontheright,anddifferentcolorsrepresentthevaluesoflog2FC.3.3DkADH/PDC/PK克隆及序列分析基于3.2結(jié)果，將轉(zhuǎn)錄組獲得的DkADH/PDC/PK的編碼序列，經(jīng)過(guò)RACE實(shí)驗(yàn)對(duì)未獲得全長(zhǎng)的基因DkADH4和DkPDC1進(jìn)行序列擴(kuò)增，并提取所有序列進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，再經(jīng)過(guò)BLAST進(jìn)行序列對(duì)比，最后確定DkADH/PDC/PK基因各四個(gè)，其中DkADH1和DkPDC1/2/3是本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)現(xiàn)并命名的基因（Min等，2012），DkPK1/4/6/8是國(guó)內(nèi)其他課題組已被發(fā)表并命名的基因（Guan等，2016；2017），根據(jù)NCBI登錄的序列情況，將新獲得序列命名為DkADH4/5/6

浙江大學(xué)碩士畢業(yè)論文3結(jié)果與分析173.4DkADH/PDC/PK蛋白結(jié)構(gòu)域分析ADH的典型保守結(jié)構(gòu)域包括ADH-N結(jié)構(gòu)域，DAN（+）結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及鋅結(jié)合位點(diǎn)（Murzin等，1996），4個(gè)ADH蛋白都含有ADH-N催化結(jié)構(gòu)域，鋅結(jié)合位點(diǎn)位于其中。他們的DAN（+）結(jié)合蛋白表現(xiàn)有所不同，DkADH1和DkADH4都是ADH_zinc_N結(jié)構(gòu)域，DkADH5和DkADH6比較相似，都含有ADH_zinc_N_2結(jié)構(gòu)域，DkADH6多了一個(gè)2-Hacid_dh_2結(jié)構(gòu)域（圖3.3a）。4個(gè)PDC蛋白均包含TPP_enzyme_N、TPP_enzyme_M、TPP_enzyme_C三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。PDC是焦磷酸硫胺素（TPP）依賴性的非氧化酶，TPP_enzyme_N是TTP酶的N端連接域，TPP_enzyme_M是TPP酶的中心區(qū)域，包含有兩個(gè)Rossmann折疊，TPP_enzyme_C為T(mén)PP酶的C端連接域（圖3.3b）。4個(gè)PK蛋白都具有典型的PK結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域，且DkPK1/2/8保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸位置都比較接近，DkPK6稍顯例外，2個(gè)結(jié)構(gòu)域位置離氨基酸N端較遠(yuǎn)（圖3.3c）。圖3.3DkADH/PDC/PK蛋白結(jié)構(gòu)域分析(a)DkADH蛋白結(jié)構(gòu)示意圖；（b）DkPDC蛋白結(jié)構(gòu)示意圖；（c）DkPK蛋白結(jié)構(gòu)示意圖；Figure3.3DkADH/PDC/PKproteindomainanalysis(a)SchemeofconservativedomiansofDkADH;(b)SchemeofconservativedomiansofDkPDC;(c)SchemeofconservativedomiansofDkPK

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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