發(fā)布時(shí)間：2021-02-14 15:21

　　轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種為荔枝育種提供了新的方向,不僅可以加快育種進(jìn)程,還可定向改良性狀。建立、優(yōu)化轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系,挖掘、鑒定功能基因及其啟動(dòng)子的表達(dá)和調(diào)控規(guī)律,這兩方面是應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種的關(guān)鍵。本研究建立了以妃子笑荔枝胚性愈傷組織為外植體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)體系,以及花粉管通道法導(dǎo)入荔枝花序的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系；同時(shí),本研究還克隆獲得了荔枝類(lèi)甜蛋白基因（LcTLP）的啟動(dòng)子,并且構(gòu)建了啟動(dòng)子缺失的植物表達(dá)載體,然后用基因槍瞬時(shí)表達(dá)法驗(yàn)證其表達(dá)規(guī)律。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：1、以妃子笑胚性愈傷組織為外植體,進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法體系最優(yōu)條件的摸索。結(jié)果顯示：農(nóng)桿菌EHA105對(duì)妃子笑胚性愈傷的侵染能力強(qiáng)于LBA4404；重懸至濃度為OD600=0.6的菌液,侵染愈傷組織30min,25℃,共培養(yǎng)2天,獲得的轉(zhuǎn)化效果最好；重懸液中添加100nmol/L的乙酰丁香酮可以有效提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率；40mg/L的潮霉素和700mg/L羧芐青霉素的組合是適宜的妃子笑抗性愈傷組織篩選劑。2、準(zhǔn)確把握荔枝花的花粉管通道伸長(zhǎng)到達(dá)胚囊的時(shí)間,是有效運(yùn)用花粉管通道法的關(guān)鍵前提。本研究結(jié)果顯示,荔枝雌花授粉后約24h,是花粉... 

【文章來(lái)源】：海南大學(xué)海南省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：73 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 轉(zhuǎn)基因相關(guān)簡(jiǎn)介
        1.1.1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)
        1.1.2 轉(zhuǎn)基因育種
        1.1.3 啟動(dòng)子的分類(lèi)及應(yīng)用價(jià)值
    1.2 果樹(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)相關(guān)研究
        1.2.1 果樹(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的方法
        1.2.2 影響果樹(shù)轉(zhuǎn)基因效率的因素
        1.2.3 果樹(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種中功能基因的研究及應(yīng)用
        1.2.4 果樹(shù)轉(zhuǎn)基因育種中啟動(dòng)子的研究舉例
    1.3 荔枝轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究進(jìn)展
        1.3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的相關(guān)研究
        1.3.2 基因槍轉(zhuǎn)化法的相關(guān)研究
        1.3.3 荔枝轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究中存在的問(wèn)題
        1.3.4 荔枝類(lèi)甜蛋白基因啟動(dòng)子研究的意義
    1.4 研究目的及意義
    1.5 研究?jī)?nèi)容
2 材料與基本實(shí)驗(yàn)操作
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌種及載體
        2.1.3 酶和試劑
        2.1.4 引物合成及測(cè)序
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.6 培養(yǎng)基和溶液的配制
    2.2 基本實(shí)驗(yàn)操作
        2.2.1 提取基因組DNA
        2.2.2 凝膠純化回收
        2.2.3 質(zhì)粒提取
        2.2.4 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.5 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        2.2.6 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α
3 方法
    3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)妃子笑胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化體系的建立
        3.1.1 妃子笑胚性愈傷組織的誘導(dǎo)
        3.1.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化胚性愈傷組織影響因子的研究
        3.1.3 最優(yōu)條件下農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化胚性愈傷組織
        3.1.4 抗性愈傷組織及體胚的檢測(cè)
    3.2 花粉管通道法轉(zhuǎn)化荔枝的研究
        3.2.1 荔枝的開(kāi)花習(xí)性及受精過(guò)程
        3.2.2 花粉管通道法轉(zhuǎn)化荔枝
        3.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)
        3.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理分析
    3.3 荔枝類(lèi)甜蛋白基因啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析
        3.3.1 荔枝基因組DNA的提取
        3.3.2 荔枝基因組DNA擴(kuò)增
        3.3.3 LcTLP啟動(dòng)子缺失片段的獲得
        3.3.4 啟動(dòng)子缺失植物表達(dá)載體構(gòu)建
        3.3.5 啟動(dòng)子缺失植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        3.3.6 基因槍法進(jìn)行啟動(dòng)子缺失植物表達(dá)載體瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證
4 結(jié)果
    4.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化胚性愈傷組織影響因子的研究
        4.1.1 妃子笑胚性愈傷組織對(duì)卡那霉素的耐受性
        4.1.2 妃子笑胚性愈傷組織對(duì)潮霉素的耐受性
        4.1.3 妃子笑胚性愈傷組織對(duì)羧芐青霉素的耐受性
        4.1.4 農(nóng)桿菌菌株的侵染力影響
        4.1.5 不同質(zhì)粒的影響
        4.1.6 菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響
        4.1.7 侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響
        4.1.8 乙酰丁香酮濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響
        4.1.9 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響
        4.1.10 抗性愈傷組織和體胚的GUS染色檢測(cè)
        4.1.11 抗性體胚的PCR檢測(cè)
    4.2 花粉管通道法轉(zhuǎn)化荔枝的研究
        4.2.1 雌花最適的操作時(shí)間選擇
        4.2.2 PCR檢測(cè)結(jié)果
        4.2.3 GUS染色結(jié)果
        4.2.4 表型比較
        4.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理分析
    4.3 荔枝類(lèi)甜蛋白基因啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析
        4.3.1 荔枝基因組DNA擴(kuò)增
        4.3.2 啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析
        4.3.3 LcTLP啟動(dòng)子缺失植物表達(dá)載體的構(gòu)建及基因槍瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證
5 討論
    5.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)妃子笑胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化體系的建立
    5.2 花粉管通道法轉(zhuǎn)化荔枝的研究
    5.3 荔枝類(lèi)甜蛋白基因啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
縮略語(yǔ)表
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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[3]基于組織培養(yǎng)和授粉后浸蘸花柱的兩種棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[D]. 陳天子.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009
[4]玉米遺傳圖譜構(gòu)建和花粉管通道法轉(zhuǎn)化玉米的研究[D]. 張永生.山東大學(xué) 2005

碩士論文
[1]哈密大棗、木納格葡萄再生體系建立及遺傳轉(zhuǎn)化研究[D]. 徐明.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[2]草莓類(lèi)胡蘿卜素基因psy、pds遺傳轉(zhuǎn)化研究[D]. 陳敏氡.福建農(nóng)林大學(xué) 2014
[3]海島棉莖尖的基因槍轉(zhuǎn)化體系的建立[D]. 馬玲玲.石河子大學(xué) 2013
[4]YHem1基因轉(zhuǎn)化香蕉提高其抗冷性的研究[D]. 韓麗曉.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[5]iaaM基因轉(zhuǎn)化‘美人指’葡萄的研究[D]. 周蓓蓓.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009
[6]草莓轉(zhuǎn)基因再生體系的建立及早花基因PcFT的轉(zhuǎn)化[D]. 鄭晶晶.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
[7]荔枝轉(zhuǎn)基因胚性愈傷組織原生質(zhì)體高頻率再生[D]. 黃枝英.福建農(nóng)林大學(xué) 2006



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