牛乳腺炎是奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的常見疾病,每年由于本病的發(fā)生給養(yǎng)殖場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。金黃色葡萄球菌作為傳染性乳腺炎的主要病原體,可侵入牛乳腺上皮細(xì)胞,從而逃避免疫防御并導(dǎo)致持續(xù)感染。最近,自噬被認(rèn)為是宿主細(xì)胞清除細(xì)胞內(nèi)病原體的重要機(jī)制,故在本研究中,通過(guò)建立金黃色葡萄球菌對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞胞內(nèi)感染模型,從胞內(nèi)病原存活與細(xì)胞自噬的角度,選取其中的關(guān)鍵蛋白p38α進(jìn)行分析。通過(guò)Western Blot檢測(cè)p38α的活化水平來(lái)驗(yàn)證金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)MAC-T細(xì)胞自噬過(guò)程中可能激活p38MAPK信號(hào)通路。隨后,為了進(jìn)一步驗(yàn)證p38MAPK在金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)MAC-T細(xì)胞自噬過(guò)程中的作用,利用p38α抑制劑SB203580和激活劑anisomycin干預(yù)胞內(nèi)感染模型,免疫熒光分析胞內(nèi)LC3陽(yáng)性聚集點(diǎn)（自噬體）水平,同時(shí)Western Blot檢測(cè)P62和LC3蛋白變化。通過(guò)Western Blot檢測(cè)ULK1^ser757磷酸化進(jìn)而驗(yàn)證p38α通過(guò)磷酸化ULK1^ser757位點(diǎn)抑制自噬,進(jìn)而影響胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的存活。結(jié)果表明:金黃色葡萄球菌感染MAC-T... 

【文章來(lái)源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

p38α活性對(duì)自噬流的影響

p38α調(diào)控胞內(nèi)金葡菌抑制牛乳腺上皮細(xì)胞自噬的機(jī)制30圖3.3p38α活性變化誘導(dǎo)LC3和P62蛋白表達(dá)影響(A)添加SB203580(30Μm)使用WesterBlot檢測(cè)=P38α/P-P38α、LC3-II/LC3-I和P62蛋白水平以及定量分析。(B)添加anisomycin(10Μm)使用WesterBlot檢測(cè)P38α/P-P38α、LC3-II/LC3-I和P62蛋白水平以及定量分析。（C）檢測(cè)LC3免疫熒光陽(yáng)性聚集點(diǎn)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，N=3。（*，P<0.05;**，P<0.01）

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文31ULK1是ATG1在哺乳動(dòng)物中的同源蛋白，ULK1的活化決定了自噬的起始，而ULK1ser757的磷酸化阻止了細(xì)胞自噬的進(jìn)程，所以，為了探討金葡菌感染MAC-T中P38α活性的變化是否對(duì)ULK1ser757位點(diǎn)存在影響，從而影響自噬。我們通過(guò)使用抑制劑SB203580以及激活劑anisomycin后,在金葡菌感染MAC-T細(xì)胞6h時(shí)，檢測(cè)ULK1ser757磷酸化水平。結(jié)果如圖所示，添加SB203580后相比金葡菌誘導(dǎo)的ULK1ser757位點(diǎn)的磷酸化水平的顯著降低，添加anisomycin后相比金葡菌誘導(dǎo)的ULK1ser757位點(diǎn)的磷酸化水平的顯著升高。則可表明，p38α活化后可以通過(guò)磷酸化ULK1sre757進(jìn)而抑制MAC-T細(xì)胞的自噬（圖3.4）。圖3.4p38α活性變化誘導(dǎo)ULK1ser757蛋白表達(dá)影響（A）分別使用SB203580(30Μm)和anisomycin(10Μm)改變p38MAPK活性，通過(guò)WesternBlot檢測(cè)ULK1和P-ULK1ser757。（B）定量分析P-ULK1ser757/ULK1。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，N=3。（*，P<0.05;**，P<0.01）3.4P38α通過(guò)磷酸化ULK1ser757位點(diǎn)水平抑制金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的自噬


本文編號(hào)：2994228