SlmiR168a介導(dǎo)的SlAGO1調(diào)控番茄低鉀脅迫的分子機(jī)制研究
發(fā)布時(shí)間：2021-01-16 04:55
番茄（Solanaceae Lycopersicon Mill）在其發(fā)育階段離不開鉀元素的供給,缺鉀會(huì)嚴(yán)重影響其果實(shí)的品質(zhì)和數(shù)量。但現(xiàn)如今我國(guó)農(nóng)田土壤中嚴(yán)重缺少可被吸收利用的鉀元素,所以培育耐低鉀型的番茄品種是提高番茄吸收鉀素效率、適應(yīng)缺鉀土壤的有效方法。課題組前期通過鑒定番茄低鉀脅迫下生物量、產(chǎn)量等指標(biāo)獲得了低鉀敏感型番茄JZ18和耐低鉀型番茄JZ34,通過組學(xué)及轉(zhuǎn)基因番茄材料的分析發(fā)現(xiàn)miR168a影響低鉀脅迫下番茄側(cè)根根毛發(fā)育,提高耐低鉀性。已有研究表明SlAGO1是番茄miR168a的靶基因。但對(duì)于miR168a調(diào)控的AGO1參與番茄耐低鉀脅迫的分子機(jī)制尚不清楚。本研究通過對(duì)SlAGO1進(jìn)行定點(diǎn)突變使之不受miR168a的調(diào)控并且不改變其氨基酸序列,構(gòu)建了35S:mSlAGO1（mutant AGO1）轉(zhuǎn)基因番茄材料。對(duì)轉(zhuǎn)基因株系35S:mSlAGO1和miR168a過表達(dá)純合株系（35S:SlmiR168a）的低鉀耐性進(jìn)行了分析。研究結(jié)果為深入解析miRNA響應(yīng)低鉀脅迫的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ),也可為番茄的耐低鉀新品種選育提供新方向。主要研究結(jié)果如下:1.RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AG...
【文章來源】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)遼寧省
【文章頁數(shù)】：59 頁
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
JZ18番茄中AGO1的表達(dá)分析
結(jié)果與分析22結(jié)果與分析3.1SlAGO1在番茄中的組織表達(dá)分析提取JZ18番茄各個(gè)部位的RNA后反轉(zhuǎn)成cDNA,利用熒光實(shí)時(shí)定量技術(shù)分析SlAGO1基因在JZ18番茄中的組織表達(dá)模式，結(jié)果表明SlAGO1在番茄中的根莖葉和果實(shí)中均有表達(dá)，SlAGO1在葉片中表達(dá)最高，在果實(shí)中表達(dá)最少，其表達(dá)量在果實(shí)的不同時(shí)期存在差異，在轉(zhuǎn)色過程中表達(dá)量最高，而最低表達(dá)量出現(xiàn)在紅熟期。圖3-1JZ18番茄中AGO1的表達(dá)分析圖3-1ExpressionanalysisofAGO1inJZ18Tomato3.2mAGO1片段的獲得獲得JZ18的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得JZ18的AGO1的cDNA序列，進(jìn)行PCR產(chǎn)物的測(cè)序，以此測(cè)得序列為基礎(chǔ)，根據(jù)Sly-MiR168a成熟體結(jié)合序列特征，設(shè)計(jì)針對(duì)結(jié)合部位序列的堿基突變引物，進(jìn)行4個(gè)堿基突變，喪失miR168a對(duì)AGO1的切割功能，但是不影響AGO1的氨基酸序列。圖2為miR168與AGO1的互補(bǔ)位點(diǎn)序列，箭頭所指的位置為剪切位點(diǎn)。將定點(diǎn)突變的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，圖3-2為定點(diǎn)突變后的測(cè)序序列，并發(fā)現(xiàn)結(jié)合位點(diǎn)突變的4個(gè)堿基與預(yù)期相同，AGO1為原始序列，mAGO1為突變后序列。圖3-2miR168a靶位點(diǎn)堿基突變的序列圖Figure3-2SequencediagramofbasemutationofmiR168atargetsiteAGO1mAGO1
沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文233.3過表達(dá)載體35S:mSlAGO1的構(gòu)建設(shè)計(jì)基因重組的引物序列，對(duì)已獲得的突變基因mAGO1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，用SmaⅠ和XbaⅠ切割過表達(dá)熒光載體，之后利用基因重組酶將PCR產(chǎn)物mAGO1連接到過表達(dá)熒光載體pCAMBIA3301/Luc中，mAGO1目的片段長(zhǎng)度為3100bp，圖3-3為PCR產(chǎn)物mAGO1的目的片段，片段長(zhǎng)度符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果。圖3-3目的片段PCR擴(kuò)增Figure3-3PCRamplificationofthetargetfragment注：M.DL1kbDNAmarker;1-4,目的片段Note:M.DL1kbDNAmarker;1-4,Purposefragment提取質(zhì)粒后繼續(xù)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，圖3-4為轉(zhuǎn)化后對(duì)可能的陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定。圖3-435S:mSlAGO1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404菌液檢測(cè)電泳圖Figure3-4Agarosegelof35S:mSlAGO1inLBA4404注：M.DL1kbDNAmarker;1,水；2，陽性對(duì)照；3-8mAGO1基因條帶Note:M.DL1kbDNAmarker;1，water；2，Positivecontrol；3-8,mAGO1Purposefragment3.4SlAGO1蛋白的亞細(xì)胞定位克隆得到JZ18的cDNA，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增SlAGO1的目的片段，片段長(zhǎng)度為3100bp，條帶顯示單一(圖3-5)，利用KpnⅠ切割GFP1302載體，在基因重組酶的作用下鏈接目2500bp5000bp3100bp12345678M2500bp5000bp3100bp1234M
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]miRNA調(diào)控植物抗逆機(jī)制的研究現(xiàn)狀[J]. 李昕晏,崔杰,李俊良,王琮玉,羅成飛. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué). 2019(21)
[2]氮磷鉀肥對(duì)設(shè)施番茄產(chǎn)量與含糖量的影響[J]. 鄭新娟,徐柏林. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2019(21)
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[4]Zm HAK5 and Zm HAK1 function in K+ uptake and distribution in maize under low K+ conditions[J]. Ya-Juan Qin,Wei-Hua Wu,Yi Wang. Journal of Integrative Plant Biology. 2019(06)
[5]低鉀脅迫下外源生長(zhǎng)素對(duì)煙草根系生長(zhǎng)及鉀吸收的影響[J]. 郭澤,李子紳,代曉燕,王英鋒. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào). 2019(07)
[6]擬南芥AGO基因家族分析及鹽脅迫下的表達(dá)驗(yàn)證[J]. 岳路明,宋劍波,徐曉峰,楊海奇,莫小為,宋軍,莫蓓莘. 深圳大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版). 2017(04)
[7]大豆microRNA168調(diào)控植物低磷脅迫響應(yīng)[J]. 呂春雨,沙愛華. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào). 2017(03)
[8]毛竹miR398和miR408的克隆及其表達(dá)分析[J]. 李利超,孫化雨,楊意宏,趙韓生,王思寧,高志民. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào). 2017(03)
[9]植物K+通道AKT1的研究進(jìn)展[J]. 伍國(guó)強(qiáng),水清照,馮瑞軍. 植物學(xué)報(bào). 2017(02)
[10]低鉀脅迫對(duì)大豆根系滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及產(chǎn)量影響[J]. 邢靜,趙凱能,黨現(xiàn)什,安俊朋,王曉光,于海秋,趙新華,蔣春姬. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2016(12)
博士論文
[1]番茄miR1916和miR396在植物響應(yīng)脅迫中的作用機(jī)制[D]. 陳磊.大連理工大學(xué) 2018
[2]番茄AGO基因的分離鑒定及SlmiR168、AGO1在番茄生長(zhǎng)發(fā)育過程中的功能研究[D]. 先志強(qiáng).重慶大學(xué) 2014
碩士論文
[1]miR156及其靶基因SPL9調(diào)控植物免疫機(jī)制研究[D]. 尹宏標(biāo).浙江師范大學(xué) 2019
[2]Sly-miR168α調(diào)控番茄鉀養(yǎng)分吸收和利用的功能驗(yàn)證[D]. 劉楊.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[3]鹽/干旱脅迫下甜菜幼苗中miR160/164及其靶基因的表達(dá)與分析[D]. 孫宗艷.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 2017
[4]MiR398在人參高鹽、高銅脅迫中的調(diào)控作用[D]. 李躬軍.吉林大學(xué) 2016
[5]鹽芥冷響應(yīng)miRNA表達(dá)模式分析及tsa-miR396功能初探[D]. 熊雪梅.東北林業(yè)大學(xué) 2014
[6]番茄Sly-miR393的克隆、鑒定及其功能研究[D]. 林冬波.重慶大學(xué) 2012
[7]鉀對(duì)番茄產(chǎn)量及品質(zhì)的影響[D]. 由天賦.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2002
本文編號(hào)：2980191
【文章來源】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)遼寧省
【文章頁數(shù)】：59 頁
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
JZ18番茄中AGO1的表達(dá)分析
結(jié)果與分析22結(jié)果與分析3.1SlAGO1在番茄中的組織表達(dá)分析提取JZ18番茄各個(gè)部位的RNA后反轉(zhuǎn)成cDNA,利用熒光實(shí)時(shí)定量技術(shù)分析SlAGO1基因在JZ18番茄中的組織表達(dá)模式，結(jié)果表明SlAGO1在番茄中的根莖葉和果實(shí)中均有表達(dá)，SlAGO1在葉片中表達(dá)最高，在果實(shí)中表達(dá)最少，其表達(dá)量在果實(shí)的不同時(shí)期存在差異，在轉(zhuǎn)色過程中表達(dá)量最高，而最低表達(dá)量出現(xiàn)在紅熟期。圖3-1JZ18番茄中AGO1的表達(dá)分析圖3-1ExpressionanalysisofAGO1inJZ18Tomato3.2mAGO1片段的獲得獲得JZ18的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得JZ18的AGO1的cDNA序列，進(jìn)行PCR產(chǎn)物的測(cè)序，以此測(cè)得序列為基礎(chǔ)，根據(jù)Sly-MiR168a成熟體結(jié)合序列特征，設(shè)計(jì)針對(duì)結(jié)合部位序列的堿基突變引物，進(jìn)行4個(gè)堿基突變，喪失miR168a對(duì)AGO1的切割功能，但是不影響AGO1的氨基酸序列。圖2為miR168與AGO1的互補(bǔ)位點(diǎn)序列，箭頭所指的位置為剪切位點(diǎn)。將定點(diǎn)突變的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，圖3-2為定點(diǎn)突變后的測(cè)序序列，并發(fā)現(xiàn)結(jié)合位點(diǎn)突變的4個(gè)堿基與預(yù)期相同，AGO1為原始序列，mAGO1為突變后序列。圖3-2miR168a靶位點(diǎn)堿基突變的序列圖Figure3-2SequencediagramofbasemutationofmiR168atargetsiteAGO1mAGO1
沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文233.3過表達(dá)載體35S:mSlAGO1的構(gòu)建設(shè)計(jì)基因重組的引物序列，對(duì)已獲得的突變基因mAGO1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，用SmaⅠ和XbaⅠ切割過表達(dá)熒光載體，之后利用基因重組酶將PCR產(chǎn)物mAGO1連接到過表達(dá)熒光載體pCAMBIA3301/Luc中，mAGO1目的片段長(zhǎng)度為3100bp，圖3-3為PCR產(chǎn)物mAGO1的目的片段，片段長(zhǎng)度符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果。圖3-3目的片段PCR擴(kuò)增Figure3-3PCRamplificationofthetargetfragment注：M.DL1kbDNAmarker;1-4,目的片段Note:M.DL1kbDNAmarker;1-4,Purposefragment提取質(zhì)粒后繼續(xù)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，圖3-4為轉(zhuǎn)化后對(duì)可能的陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定。圖3-435S:mSlAGO1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404菌液檢測(cè)電泳圖Figure3-4Agarosegelof35S:mSlAGO1inLBA4404注：M.DL1kbDNAmarker;1,水；2，陽性對(duì)照；3-8mAGO1基因條帶Note:M.DL1kbDNAmarker;1，water；2，Positivecontrol；3-8,mAGO1Purposefragment3.4SlAGO1蛋白的亞細(xì)胞定位克隆得到JZ18的cDNA，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增SlAGO1的目的片段，片段長(zhǎng)度為3100bp，條帶顯示單一(圖3-5)，利用KpnⅠ切割GFP1302載體，在基因重組酶的作用下鏈接目2500bp5000bp3100bp12345678M2500bp5000bp3100bp1234M
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期刊論文
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[6]擬南芥AGO基因家族分析及鹽脅迫下的表達(dá)驗(yàn)證[J]. 岳路明,宋劍波,徐曉峰,楊海奇,莫小為,宋軍,莫蓓莘. 深圳大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版). 2017(04)
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[10]低鉀脅迫對(duì)大豆根系滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及產(chǎn)量影響[J]. 邢靜,趙凱能,黨現(xiàn)什,安俊朋,王曉光,于海秋,趙新華,蔣春姬. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2016(12)
博士論文
[1]番茄miR1916和miR396在植物響應(yīng)脅迫中的作用機(jī)制[D]. 陳磊.大連理工大學(xué) 2018
[2]番茄AGO基因的分離鑒定及SlmiR168、AGO1在番茄生長(zhǎng)發(fā)育過程中的功能研究[D]. 先志強(qiáng).重慶大學(xué) 2014
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[1]miR156及其靶基因SPL9調(diào)控植物免疫機(jī)制研究[D]. 尹宏標(biāo).浙江師范大學(xué) 2019
[2]Sly-miR168α調(diào)控番茄鉀養(yǎng)分吸收和利用的功能驗(yàn)證[D]. 劉楊.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[3]鹽/干旱脅迫下甜菜幼苗中miR160/164及其靶基因的表達(dá)與分析[D]. 孫宗艷.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 2017
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[5]鹽芥冷響應(yīng)miRNA表達(dá)模式分析及tsa-miR396功能初探[D]. 熊雪梅.東北林業(yè)大學(xué) 2014
[6]番茄Sly-miR393的克隆、鑒定及其功能研究[D]. 林冬波.重慶大學(xué) 2012
[7]鉀對(duì)番茄產(chǎn)量及品質(zhì)的影響[D]. 由天賦.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2002
本文編號(hào)：2980191
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