豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病,主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙以及仔豬的呼吸系統(tǒng)疾病。2014年底,PRRSV NADC30-like毒株在我國大規(guī)模流行,其Nsp2區(qū)域與HP-PRRSV毒株的Nsp2區(qū)域缺失不同,存在多個氨基酸的不連續(xù)缺失。此次疫情給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),2014年后我國HP-PRRSV的陽性率逐年下降,而NADC30-like毒株的陽性率逐年升高,我國PRRSV流行毒株逐漸由HP-PRRSV毒株向NADC30-like毒株轉(zhuǎn)變。本研究本著以防控該病并進一步進行亞型的鑒別診斷為目的,以PRRSV NADC30-like QHD1毒株的Nsp2為研究對象,開展了針對Nsp2單克隆抗體制備的相關(guān)研究。主要研究內(nèi)容包括:1.PRRSV Nsp2蛋白單克隆抗體的制備在本實驗室已分離到的QHD1毒株的基礎(chǔ)上,通過設(shè)計特異性引物擴增Nsp2基因,利用原核表達系統(tǒng)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a（+）-Nsp2,以此為抗原免疫Balb/c小鼠,經(jīng)血清效價檢測分析,進... 

【文章來源】：河北科技師范學(xué)院河北省

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

病豬臨床癥狀Fig.1-1clinicalsymptomsofsickpigs

第二章PRRSVNADC30-likeNsp2蛋白單克隆抗體的制備12第二章PRRSVNADC30-likeNsp2蛋白單克隆抗體的制備2014年NADC30-like毒株暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)致命一擊。NADC30-like毒株是PRRSV的一個新毒株，該毒株與HP-PRRSV最大的不同是在Nsp2高變區(qū)出現(xiàn)多個氨基酸的不連續(xù)缺失。之后的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，NADC30-like毒株數(shù)量呈上升趨勢，為此很有必要對其進行研究。Nsp2蛋白B細胞表位較豐富，親水性較強，免疫原性較強，是目前研究的熱點。通過原核表達系統(tǒng)進行蛋白的誘導(dǎo)表達是一項很成熟的技術(shù)。利用常規(guī)的細胞融合技術(shù)進行單克隆抗體的制備，并用多種方法進行驗證，使得制備出的單抗特異性強，為臨床從抗體水平上對NADC30-like毒株進行鑒別診斷提供技術(shù)手段。2.1試驗材料2.1.1毒株、細胞與菌株毒株：PRRSVNADC30-likeQHD1毒株由本實驗室分離鑒定。菌種：大腸桿菌DH5α、BL21感受態(tài)細胞均由本實驗室制備并保存。細胞：SP2/0細胞和PAM細胞均由本實驗室制備并保存。2.1.2載體與質(zhì)粒載體：pMDTM18-T克隆載體購自大連寶生物（TaKaRa）公司（圖2-1）。原核表達載體pET-32a(+)為本實驗室保存（圖2-2）。圖2-1克隆載體pMDTM18-T限制性圖譜Fig.2-1RestrictionmapofpMDTM18-Tvector

第二章PRRSVNADC30-likeNsp2蛋白單克隆抗體的制備13圖2-2原核表達載體pET-32a(+)結(jié)構(gòu)圖Fig.2-2ConstructivemapofprokaryoticexpressionvectorpET-32a(+)2.1.3實驗動物5-6周齡的Balb/c小鼠（SPF級），雌性和雄性皆有，購自湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。2.1.4主要試劑與耗材表2-1主要試劑與耗材Table2-1Themainreagentsandconsumables試劑名稱公司RNAisoPlus大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)提取RNA的其他相關(guān)試劑如氯仿等均為分析純反轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑如PrimeScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesisKit等大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)PCR所用的各種限制性內(nèi)切酶和工具酶大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)核酸染料GoodView上海賽百盛基因技術(shù)有限公司瓊脂糖LEAgarose美國HydraGeneDNA純化回收試劑盒天根生化科技（北京）有限公司T4DNA連接酶賽默飛（Thermo）公司質(zhì)粒小量提取試劑盒北京天根生物工程公司BamHI和XhoI大連寶生物（TaKaRa）公司胰蛋白胨、酵母提取物英國OXOIDS公司過硫酸銨APS瓊脂粉、十二烷基硫酸鈉SDSGigma公司蛋白純化His標簽鎳柱PC003NTA-HisTalon無錫天演生物

【參考文獻】：
期刊論文
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