發(fā)布時(shí)間：2021-01-12 00:46

　　豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病,主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙以及仔豬的呼吸系統(tǒng)疾病。2014年底,PRRSV NADC30-like毒株在我國(guó)大規(guī)模流行,其Nsp2區(qū)域與HP-PRRSV毒株的Nsp2區(qū)域缺失不同,存在多個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失。此次疫情給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),2014年后我國(guó)HP-PRRSV的陽(yáng)性率逐年下降,而NADC30-like毒株的陽(yáng)性率逐年升高,我國(guó)PRRSV流行毒株逐漸由HP-PRRSV毒株向NADC30-like毒株轉(zhuǎn)變。本研究本著以防控該病并進(jìn)一步進(jìn)行亞型的鑒別診斷為目的,以PRRSV NADC30-like QHD1毒株的Nsp2為研究對(duì)象,開(kāi)展了針對(duì)Nsp2單克隆抗體制備的相關(guān)研究。主要研究?jī)?nèi)容包括:1.PRRSV Nsp2蛋白單克隆抗體的制備在本實(shí)驗(yàn)室已分離到的QHD1毒株的基礎(chǔ)上,通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增Nsp2基因,利用原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a（+）-Nsp2,以此為抗原免疫Balb/c小鼠,經(jīng)血清效價(jià)檢測(cè)分析,進(jìn)... 

【文章來(lái)源】：河北科技師范學(xué)院河北省

【文章頁(yè)數(shù)】：84 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

病豬臨床癥狀Fig.1-1clinicalsymptomsofsickpigs

第二章PRRSVNADC30-likeNsp2蛋白單克隆抗體的制備12第二章PRRSVNADC30-likeNsp2蛋白單克隆抗體的制備2014年NADC30-like毒株暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)致命一擊。NADC30-like毒株是PRRSV的一個(gè)新毒株，該毒株與HP-PRRSV最大的不同是在Nsp2高變區(qū)出現(xiàn)多個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失。之后的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，NADC30-like毒株數(shù)量呈上升趨勢(shì)，為此很有必要對(duì)其進(jìn)行研究。Nsp2蛋白B細(xì)胞表位較豐富，親水性較強(qiáng)，免疫原性較強(qiáng)，是目前研究的熱點(diǎn)。通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)是一項(xiàng)很成熟的技術(shù)。利用常規(guī)的細(xì)胞融合技術(shù)進(jìn)行單克隆抗體的制備，并用多種方法進(jìn)行驗(yàn)證，使得制備出的單抗特異性強(qiáng)，為臨床從抗體水平上對(duì)NADC30-like毒株進(jìn)行鑒別診斷提供技術(shù)手段。2.1試驗(yàn)材料2.1.1毒株、細(xì)胞與菌株毒株：PRRSVNADC30-likeQHD1毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。菌種：大腸桿菌DH5α、BL21感受態(tài)細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。細(xì)胞：SP2/0細(xì)胞和PAM細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。2.1.2載體與質(zhì)粒載體：pMDTM18-T克隆載體購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa）公司（圖2-1）。原核表達(dá)載體pET-32a(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存（圖2-2）。圖2-1克隆載體pMDTM18-T限制性圖譜Fig.2-1RestrictionmapofpMDTM18-Tvector

第二章PRRSVNADC30-likeNsp2蛋白單克隆抗體的制備13圖2-2原核表達(dá)載體pET-32a(+)結(jié)構(gòu)圖Fig.2-2ConstructivemapofprokaryoticexpressionvectorpET-32a(+)2.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5-6周齡的Balb/c小鼠（SPF級(jí)），雌性和雄性皆有，購(gòu)自湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。2.1.4主要試劑與耗材表2-1主要試劑與耗材Table2-1Themainreagentsandconsumables試劑名稱公司RNAisoPlus大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)提取RNA的其他相關(guān)試劑如氯仿等均為分析純反轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑如PrimeScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesisKit等大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)PCR所用的各種限制性內(nèi)切酶和工具酶大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)核酸染料GoodView上海賽百盛基因技術(shù)有限公司瓊脂糖LEAgarose美國(guó)HydraGeneDNA純化回收試劑盒天根生化科技（北京）有限公司T4DNA連接酶賽默飛（Thermo）公司質(zhì)粒小量提取試劑盒北京天根生物工程公司BamHI和XhoI大連寶生物（TaKaRa）公司胰蛋白胨、酵母提取物英國(guó)OXOIDS公司過(guò)硫酸銨APS瓊脂粉、十二烷基硫酸鈉SDSGigma公司蛋白純化His標(biāo)簽鎳柱PC003NTA-HisTalon無(wú)錫天演生物

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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