發(fā)布時間：2021-01-10 14:29

　　蘿卜硫素（Sulforaphane,SFN）又稱萊菔子素,是一種含硫有機化合物,是目前防癌抗癌效果最好的植物天然產物之一,它能誘導機體產生II型解毒酶,使癌細胞程序性凋亡并起到防癌功能。十字花科蕓薹屬植物西蘭花是生產SFN的重要材料,但目前普通西蘭花中SFN產量仍無法滿足巨大的市場需求,使用成苗作為生產材料會大幅增加生產成本,通過西蘭花無菌細胞系生產SFN可縮短生產周期,是一種新型生產方式。之前單一基因改造提高植物SFN含量的策略效果并不理想。本研究從西蘭花中克隆了 SFN合成相關的支鏈氨基酸轉移酶4編碼基因BCAT4、細胞色素P450氧化酶編碼基因CYP79F1和環(huán)硫修飾酶編碼基因ESM1。分別以單基因導入和三基因串聯(lián)導入的方式,通過農桿菌法轉化西蘭花愈傷組織,對所獲得的轉化細胞系中SFN的含量進行比較,以期獲得SFN含量更高的細胞系,為通過細胞系大量培養(yǎng)獲取SFN奠定基礎。本文主要研究結果如下:1、目的基因克隆:提取西蘭花總RNA,并反轉錄出cDNA;利用ESM1（GenBank No.XM013728577.1）、CYP79F1（GenBank No.MG012890.1）、BC... 

【文章來源】：山西大學山西省

【文章頁數】：66 頁

【學位級別】：碩士

【圖文】：

西蘭花RNA凝膠電泳檢測

BCAT4、CYP79F1和ESM1過表達提高西蘭花細胞蘿卜硫素含量的研究22圖2.2目的基因PCR擴增M:DNA分子標記;1:基因CYP79F1PCR擴增條帶;2:基因ESM1PCR擴增條帶;3:基因BCAT4PCR擴增條帶Fig.2.2AmplificationoftargetgeneM:DNAMarker;1:AmplificationofgeneCYP79F1;2:AmplificationofgeneESM1;3:AmplificationofgeneBCAT4.2.4.3單基因過表達載體與三基因串聯(lián)共表達載體的構建為增加青花菜細胞內與蘿卜硫素生成有關基因表達水平，通過同源重組的方式構建了基因ESM1、CYP79F1和BCAT4的單基因過表達載體和BCAT4N-SCYP79F1N-SESM1(B-C-E)三基因串聯(lián)共表達載體。重組質粒T-DNA區(qū)域如圖1D所示，轉化E.coli-DH5α，通過菌液PCR鑒定陽性菌株，通過雙酶切對單基因重組質粒進行鑒定，結果如圖1A-C所示(BCAT4序列中含EcoR酶切位點，會釋放947bp的片段)。測序結果與參考序列比對表明載體構建成功。分別將三個單基因過表達載體作為PCR擴增模板，擴增得到SCYP79F1N、SESM1、BACT4N表達框部分，其中的35S啟動子編碼序列、Nos3"UTR編碼序列、His標簽蛋白編碼序列和HA標簽蛋白編碼序列源于載體XF-350，擴增結果如圖1E所示，使用同源重組的方式將三個目的基因表達框與載體相連，轉化E.coli-DH5α后PCR鑒別陽性菌株，重組質粒使用雙酶切進行鑒定，結果如圖1F泳道2所示，條帶大小正確，測序結果與參考序列比對無誤，質粒構建成功。圖1F泳道1中條帶為雙基因重組質粒XF350-BCAT4N-SCYP79F1N雙酶切所釋放，大小正確，但因測序失敗沒有啟用。

單基因重組載體及三基因串聯(lián)載體的構建


本文編號：2968875