蘿卜硫素（Sulforaphane,SFN）又稱(chēng)萊菔子素,是一種含硫有機(jī)化合物,是目前防癌抗癌效果最好的植物天然產(chǎn)物之一,它能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生II型解毒酶,使癌細(xì)胞程序性凋亡并起到防癌功能。十字花科蕓薹屬植物西蘭花是生產(chǎn)SFN的重要材料,但目前普通西蘭花中SFN產(chǎn)量仍無(wú)法滿足巨大的市場(chǎng)需求,使用成苗作為生產(chǎn)材料會(huì)大幅增加生產(chǎn)成本,通過(guò)西蘭花無(wú)菌細(xì)胞系生產(chǎn)SFN可縮短生產(chǎn)周期,是一種新型生產(chǎn)方式。之前單一基因改造提高植物SFN含量的策略效果并不理想。本研究從西蘭花中克隆了 SFN合成相關(guān)的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶4編碼基因BCAT4、細(xì)胞色素P450氧化酶編碼基因CYP79F1和環(huán)硫修飾酶編碼基因ESM1。分別以單基因?qū)牒腿虼?lián)導(dǎo)入的方式,通過(guò)農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化西蘭花愈傷組織,對(duì)所獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中SFN的含量進(jìn)行比較,以期獲得SFN含量更高的細(xì)胞系,為通過(guò)細(xì)胞系大量培養(yǎng)獲取SFN奠定基礎(chǔ)。本文主要研究結(jié)果如下:1、目的基因克隆:提取西蘭花總RNA,并反轉(zhuǎn)錄出cDNA;利用ESM1（GenBank No.XM013728577.1）、CYP79F1（GenBank No.MG012890.1）、BC... 

【文章來(lái)源】：山西大學(xué)山西省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【圖文】：

西蘭花RNA凝膠電泳檢測(cè)

BCAT4、CYP79F1和ESM1過(guò)表達(dá)提高西蘭花細(xì)胞蘿卜硫素含量的研究22圖2.2目的基因PCR擴(kuò)增M:DNA分子標(biāo)記;1:基因CYP79F1PCR擴(kuò)增條帶;2:基因ESM1PCR擴(kuò)增條帶;3:基因BCAT4PCR擴(kuò)增條帶Fig.2.2AmplificationoftargetgeneM:DNAMarker;1:AmplificationofgeneCYP79F1;2:AmplificationofgeneESM1;3:AmplificationofgeneBCAT4.2.4.3單基因過(guò)表達(dá)載體與三基因串聯(lián)共表達(dá)載體的構(gòu)建為增加青花菜細(xì)胞內(nèi)與蘿卜硫素生成有關(guān)基因表達(dá)水平，通過(guò)同源重組的方式構(gòu)建了基因ESM1、CYP79F1和BCAT4的單基因過(guò)表達(dá)載體和BCAT4N-SCYP79F1N-SESM1(B-C-E)三基因串聯(lián)共表達(dá)載體。重組質(zhì)粒T-DNA區(qū)域如圖1D所示，轉(zhuǎn)化E.coli-DH5α，通過(guò)菌液PCR鑒定陽(yáng)性菌株，通過(guò)雙酶切對(duì)單基因重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1A-C所示(BCAT4序列中含EcoR酶切位點(diǎn)，會(huì)釋放947bp的片段)。測(cè)序結(jié)果與參考序列比對(duì)表明載體構(gòu)建成功。分別將三個(gè)單基因過(guò)表達(dá)載體作為PCR擴(kuò)增模板，擴(kuò)增得到SCYP79F1N、SESM1、BACT4N表達(dá)框部分，其中的35S啟動(dòng)子編碼序列、Nos3"UTR編碼序列、His標(biāo)簽蛋白編碼序列和HA標(biāo)簽蛋白編碼序列源于載體XF-350，擴(kuò)增結(jié)果如圖1E所示，使用同源重組的方式將三個(gè)目的基因表達(dá)框與載體相連，轉(zhuǎn)化E.coli-DH5α后PCR鑒別陽(yáng)性菌株，重組質(zhì)粒使用雙酶切進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1F泳道2所示，條帶大小正確，測(cè)序結(jié)果與參考序列比對(duì)無(wú)誤，質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖1F泳道1中條帶為雙基因重組質(zhì)粒XF350-BCAT4N-SCYP79F1N雙酶切所釋放，大小正確，但因測(cè)序失敗沒(méi)有啟用。

單基因重組載體及三基因串聯(lián)載體的構(gòu)建


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