乳蛋白因其具有較高的營養(yǎng)價值和在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要性而受到關注。因此,提高奶用動物乳蛋白的產(chǎn)量,改善乳蛋白的組成一直是動物營養(yǎng)學家所關注的熱點,闡明乳蛋白合成調(diào)控的機制是目前解決上述問題的關鍵所在。本研究中通過使用T1R1 siRNA干涉小鼠乳腺上皮細胞系（HC11）中的T1R1并結(jié)合氨基酸（AA）刺激,發(fā)現(xiàn)T1R1參與小鼠乳腺上皮細胞AA的感知;抑制T1R1后HC11細胞mTOR信號通路的活性被顯著抑制。必需氨基酸轉(zhuǎn)運進入細胞受氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的識別和轉(zhuǎn)運,研究同時發(fā)現(xiàn)抑制T1R1使氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白SLC7A5、SLC3A2和SLC1A5的表達量顯著上調(diào);但細胞內(nèi)AA的濃度差異不顯著,結(jié)果也進一步的證實了敲低T1R1會使氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白表達上調(diào)而不影響細胞內(nèi)AA的濃度的已有結(jié)論。通過使用氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑2-氨基雙環(huán)-（2,2,1）-庚烷-2-羧酸（BCH）和γ-L-谷氨酰對硝基苯胺-水合物（GPNA）,證實氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白也參與mTOR信號通路的調(diào)控,T1R1 siRNA與BCH、GPNA聯(lián)合作用可以進一步抑制mTOR信號通路的活性。以T1R1基因敲除小鼠為模型,發(fā)現(xiàn)敲除T1R1可以顯著下... 

【文章來源】：江蘇師范大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
2 文獻綜述
    2.1 乳腺泌乳研究進展
        2.1.1 泌乳及其調(diào)節(jié)
        2.1.2 乳蛋白的組成及功能
        2.1.3 乳蛋白合成及調(diào)控
    2.2 mTOR信號通路研究進展
        2.2.1 mTOR信號通路概述
        2.2.2 mTOR上游信號通路
        2.2.3 mTOR下游信號通路
    2.3 氨基酸與mTOR信號通路的調(diào)控
    2.4 G蛋白偶聯(lián)受體T1R1/T1R3及對mTOR信號通路的調(diào)控
        2.4.1 G蛋白偶聯(lián)受體
        2.4.2 T1R1/T1R3與氨基酸的感知及mTOR信號通路的調(diào)控
3 T1R1/T1R3對小鼠乳腺上皮細胞系HC11細胞氨基酸的感知和乳蛋白的合成調(diào)控機制研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗樣品
        3.1.2 細胞培養(yǎng)及處理
        3.1.3 實驗所用試劑
    3.2 實驗方法
        3.2.1 RNA干涉
        3.2.2 不同抑制處理
        3.2.3 細胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        3.2.4 實時熒光定量PCR（qPCR）
        3.2.5 Western blot
        3.2.6 氨基酸濃度分析
        3.2.7 數(shù)據(jù)分析
    3.3 結(jié)果分析
        3.3.1 T1R1與T1R3在HC11細胞中的表達情況分析
        3.3.2 干涉T1R1對 β-casein的影響分析
        3.3.3 沉默T1R1對mTOR的影響
        3.3.4 抑制T1R1對氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的影響
        3.3.5 沉默T1R1和抑制氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白對mTOR信號通路的作用
        3.3.6 沉默T1R1對HC11細胞內(nèi)氨基酸濃度的影響
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
4 T1R1/T1R3對小鼠乳腺組織不同時期乳蛋白合成的調(diào)控機制研究
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗動物
        4.1.2 實驗設計
        4.1.3 實驗試劑
        4.1.4 實驗儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 小鼠基因分型
        4.2.2 實驗小鼠樣品采集
        4.2.3 冰凍切片及免疫熒光（Immunofluorescence）
        4.2.4 泌乳量測定
        4.2.5 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        4.2.6 實時熒光定量PCR
        4.2.7 Western blot
        4.2.8 數(shù)據(jù)處理
    4.3 結(jié)果分析
        4.3.1 鼠尾DNA質(zhì)量檢測
        4.3.2 小鼠基因分型
        4.3.3 小鼠乳腺組織中T1R1與T1R3的表達情況分析結(jié)果
        4.3.4 qPCR及Western blot分析T1R1在小鼠乳腺上皮細胞中的表達情況
        4.3.5 T1R1敲除小鼠與野生型小鼠泌乳量測定結(jié)果
        4.3.6 β-酪蛋白合成檢測
        4.3.7 敲除T1R1對mTOR信號通路的影響分析結(jié)果
        4.3.8 敲除T1R1對氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的影響分析結(jié)果
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
5 T1R3對T1R1 KO及WT小鼠mTOR信號通路的調(diào)控分析
    5.1 實驗材料
        5.1.1 實驗動物
        5.1.2 實驗試劑
    5.2 實驗方法
        5.2.1 外植體的準備
        5.2.2 外植體的培養(yǎng)及處理
        5.2.3 Western blot
        5.2.4 數(shù)據(jù)處理
    5.3 結(jié)果分析
        5.3.1 T1R3在小鼠乳腺中的表達分析
        5.3.2 抑制T1R3對T1R1 KO及WT小鼠mTOR信號通路的影響
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
6 結(jié)論與創(chuàng)新點
    6.1 結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新點
    6.3 展望
附錄
    附錄1 主要實驗儀器及試劑
        1.1 主要實驗儀器
        1.2 試劑
        1.3 溶液的配制
    附錄2 細胞及組織總RNA的提取
        2.1 總RNA提取步驟
        2.2 總RNA質(zhì)量分析
        2.3 總RNA濃度測定
    附錄3 Western blot實驗
        3.1 Western blot相關試劑配制
        3.2 BCA定量
        3.3 Western blot實驗步驟
    附錄4 冰凍切片及免疫熒光
        4.1 冰凍切片
        4.2 免疫熒光（雙標）
    附錄5 pMD 19-T基因克隆轉(zhuǎn)化實驗
參考文獻
致謝
作者簡歷
學位論文數(shù)據(jù)集


【參考文獻】：
期刊論文
[1]牛奶乳脂肪和乳蛋白的合成與調(diào)控機理[J]. 王加啟.  飼料與畜牧. 2011(02)

碩士論文
[1]魯西牛消化道各段T1R1、T1R3及pepT1基因的表達差異性研究[D]. 陳曉慧.江蘇師范大學 2013



本文編號：2956645