本文關(guān)鍵詞：甘蔗受黑穗病菌脅迫下microRNA差異表達(dá)及其靶基因功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：甘蔗(Saccharum spp.)是我國(guó)最重要的糖料作物和能源作物,蔗糖占我國(guó)食糖總產(chǎn)的92%。由黑粉菌(Sporisorium scitamineum, S. scitamineum)引起的甘蔗黑穗病(sugarcane smut),嚴(yán)重危害甘蔗生產(chǎn),導(dǎo)致產(chǎn)量和蔗糖分降低,給我國(guó)甘蔗產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。培育抗黑穗病甘蔗品種是控制甘蔗黑穗病危害的最經(jīng)濟(jì)有效的手段。植物與病原互作的分子機(jī)制包括轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平、翻譯后水平等多方面調(diào)控機(jī)制。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,有關(guān)甘蔗與黑穗病菌互作分子機(jī)制的研究有了長(zhǎng)足進(jìn)步,但是尚未見利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定甘蔗受黑穗病菌脅迫后microRNA (miRNA)差異表達(dá)及其靶標(biāo)基因預(yù)測(cè)和功能分析的報(bào)道。本研究首次利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定甘蔗受黑穗病菌脅迫下miRNA的差異表達(dá),從甘蔗小RNA高通量測(cè)序與niRNA鑒定注釋、差異miRNA篩選和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)表達(dá)驗(yàn)證與表達(dá)模式分析、差異miRNA的功能分析及其靶基因預(yù)測(cè)和靶基因表達(dá)分析等三個(gè)方面入手,系統(tǒng)比較了甘蔗與黑穗病菌互作系統(tǒng)的親和與不親和互作間在轉(zhuǎn)錄后水平上miRNA的調(diào)控機(jī)制,以期為甘蔗抗黑穗病分子機(jī)理的研究提供niRNA水平的佐證,豐富和深化甘蔗抗黑穗病的分子機(jī)理研究,進(jìn)而為培育抗黑穗病甘蔗品種提供miRNA水平的理論依據(jù)。miRNA具有重要的生物學(xué)功能,在植物受到生物和非生物脅迫的過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用,其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控是生物體內(nèi)一條重要的小RNA調(diào)控路徑。本研究以甘蔗抗黑穗病無性系崖城05-179 (YA05-179)和感黑穗病甘蔗品種新臺(tái)糖22 (ROC22)為研究材料,以接種黑穗病菌蔗芽作為處理組(YAT、RT),接種清水作為對(duì)照組(YACK、RCK),應(yīng)用高通量HiSeq測(cè)序技術(shù)鑒定甘蔗受黑穗病脅迫下48h的miRNA差異表達(dá),對(duì)所獲得的小RNA序列注釋并篩選出差異表達(dá)的miRNA,利用生物信息學(xué)技術(shù)與數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合對(duì)其靶向基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選出的部分差異miRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量驗(yàn)證,并進(jìn)一步分析了甘蔗與黑穗病菌互作Oh、12h、48h和96h不同時(shí)間點(diǎn)miRNA與其部分靶基因的表達(dá)模式。研究旨在找到甘蔗在黑穗病菌脅迫下發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的miRNA及其靶基因,為甘蔗抗黑穗病分子育種提供miRNA和基因資源。主要研究結(jié)果如下：1.四個(gè)甘蔗樣品的送樣質(zhì)量良好,分別測(cè)序得到符合要求的干凈序列為RCK 36396588條、RT27812972條、YACK 27464468條、YAT 28290231條,且雜質(zhì)序列含量都少于1%,故高通量測(cè)序獲得的小RNA質(zhì)量高。結(jié)合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)得的sRNAs進(jìn)行篩選注釋,其中RCK測(cè)序獲得264個(gè)已知miRNA,RT有263個(gè),YACK有260個(gè),YAT有262個(gè)。此外,在RCK、RT、YACK和YAT中分別預(yù)測(cè)出137、140、111和119個(gè)新miRNA。有堿基分布統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,四個(gè)小RNA文庫(kù)中在植物中含量較多的長(zhǎng)度為21 nt和22 nt的新niRNA序列首位點(diǎn)堿基U所占比例較大；在序列堿基11位點(diǎn),四個(gè)樣品的新miRNA序列的堿基都偏向于A,符合miRNA序列特征,說明新miRNA序列的預(yù)測(cè)結(jié)果可行性高。2.在ROC22中,篩選出231個(gè)已知miRNA,其中35個(gè)在黑穗病菌脅迫處理樣品和清水接種對(duì)照樣品間發(fā)生顯著差異表達(dá)(|log2一ratio|1,P0.05)；涉及10個(gè)上調(diào)表達(dá)和25個(gè)下調(diào)表達(dá)的miRNA:在對(duì)照組與處理組樣品中表達(dá)量差異倍數(shù)最高達(dá)4.6倍。在YA05-179中,兩個(gè)樣品中共有的已知miRNA為208個(gè),對(duì)照組與處理組中發(fā)生顯著差異表達(dá)niRNA有11個(gè)；涉及2個(gè)上調(diào)表達(dá)和9個(gè)下調(diào)表達(dá)的miRNA:對(duì)照組與處理組樣品中表達(dá)量差異倍數(shù)最高達(dá)2.1倍。在ROC22和YA05-179中,篩選出的差異表達(dá)的已知miRNA,下調(diào)表達(dá)的占多數(shù),且大部分miRNA的種類和表達(dá)趨勢(shì)是相同的。在ROC22中,篩選出的顯著差異表達(dá)(|log2-ratio|1,P0.05)的新miRNA有16個(gè),而YA05-179中有6個(gè)；其在單一品種特有的比較多,且在兩個(gè)品種中沒有發(fā)現(xiàn)共同顯著差異表達(dá)的新miRNA。本研究針對(duì)篩選出的16個(gè)差異表達(dá)的已知miRNA和新miRNA,利用qRT-PCR對(duì)其在ROC22與YA05-179兩個(gè)品種中27個(gè)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證,相符率達(dá)到了85.2%,可見本研究的測(cè)序結(jié)果可靠性較高。3.甘蔗是個(gè)高度雜合的異源多倍非整倍體作物,其全基因組測(cè)序尚未完成,因此本研究注釋的miRNA未知序列占小RNA序列的絕大多數(shù),隨后對(duì)所注釋的miRNA在甘蔗受黑穗病菌脅迫時(shí)對(duì)應(yīng)靶基因的預(yù)測(cè)及分析數(shù)據(jù)也不完整。差異表達(dá)的已知miRNA預(yù)測(cè)出的靶基因數(shù),YA05-179少于ROC22,但差異表達(dá)的新miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因數(shù)目在YA05-179中明顯多于R022。靶基因生物功能分析中,GO歸類為生物過程(biological process)、細(xì)胞組分和元件(cellular components)分子功能(molecular function)。兩個(gè)品種中,差異表達(dá)的已知miRNA靶基因的分類情況與差異表達(dá)的新miRNA所匹配的靶基因序列統(tǒng)計(jì)情況相似,即在生物過程分類中靶基因主要分布在細(xì)胞過程與代謝過程,細(xì)胞組分和元件分類中靶基因主要分布在細(xì)胞、細(xì)胞組分和細(xì)胞器中,分子功能分類中靶基因主要分布在結(jié)合與催化活性。KEGG通路富集分析顯示,差異miRNA調(diào)控的靶基因參與了一系列miRNA調(diào)控靶基因生理生化途徑或抗病相關(guān)生理代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,表明甘蔗與黑穗病菌互作的分子機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn),miR5077、 miR5671、miR5044、miR5261、miR5783、miR5221、miR6478和miR948的靶向基因在MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)和植物-病原菌互作 (Plant-pathogen interaction)中發(fā)揮重要作用并構(gòu)建了相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖。4.從miRNA靶基因中篩選了在甘蔗EST文庫(kù)中有生物功能注釋的序列,并針對(duì)所篩選出的差異表達(dá)的已知miRNA和新miRNA所對(duì)應(yīng)的部分靶基因進(jìn)行了qRT-PCR表達(dá)分析。結(jié)果顯示,在已知miRNA與其靶基因的表達(dá)分析中,大部分miRNA與其靶基因呈負(fù)調(diào)控模式,即niRNA過表達(dá)時(shí),靶基因的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)；其中8個(gè)靶基因中有7個(gè)靶基因的表達(dá)在12h后基本相符,且在48h時(shí)匹配度最高。這也從另一方面說明甘蔗受黑穗病菌脅迫后miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控作用在48h達(dá)到最高。研究還揭示,本研究中已知miRNA與靶基因表達(dá)豐度預(yù)測(cè)與功能分析的可靠性高,但在候選的新miRNA及其靶基因定量表達(dá)結(jié)果之間的負(fù)調(diào)控趨勢(shì)的符合率就沒有那么高,故還需對(duì)新miRN A的預(yù)測(cè)與分析作進(jìn)一步的挖掘。
【關(guān)鍵詞】：甘蔗黑穗病 高通量測(cè)序 miRNA差異表達(dá) 靶基因功能預(yù)測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S435.661
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第一章 綜述13-22
• 1 甘蔗與黑穗病菌互作的研究現(xiàn)狀13-16
• 1.1 甘蔗黑穗病13-14
• 1.2 甘蔗品種抗黑穗病性的形態(tài)和生理生化機(jī)理研究14
• 1.3 甘蔗品種抗黑穗病性的分子機(jī)理研究14-16
• 2 植物miRNA研究概況16-19
• 2.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)16-17
• 2.2 miRNA的起源、加工與合成17
• 2.3 miRNA的命名規(guī)則17
• 2.4 miRNA的作用機(jī)制17-18
• 2.5 miRNA與植物的生長(zhǎng)發(fā)育18
• 2.6 miRNA與植物激素的調(diào)節(jié)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)18-19
• 2.7 miRNA與植物生物和非生物脅迫19
• 3 植物miRNA的獲得與檢測(cè)19-20
• 4 研究背景、目的與意義20-21
• 5 技術(shù)路線21-22
• 第二章 甘蔗小RNA高通量測(cè)序和miRNA的鑒定與注釋22-39
• 1 實(shí)驗(yàn)材料22-23
• 1.1 甘蔗黑穗病菌孢子收集22
• 1.2 植物材料及處理22-23
• 1.3. 主要試劑23
• 1.4 主要儀器設(shè)備23
• 1.5 主要使用的數(shù)據(jù)庫(kù)23
• 2 實(shí)驗(yàn)方法23-25
• 2.1 總RNA提取23
• 2.2 總RNA質(zhì)量檢測(cè)23-24
• 2.2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)24
• 2.2.2 酶標(biāo)儀與Agilent 2100檢測(cè)24
• 2.3 HiSeq測(cè)序24-25
• 3 結(jié)果與分析25-37
• 3.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)25-26
• 3.1.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)25-26
• 3.1.2 酶標(biāo)儀與Agilent 2100檢測(cè)26
• 3.2 測(cè)得小RNA數(shù)據(jù)的評(píng)估26-28
• 3.2.1 測(cè)得小RNA數(shù)據(jù)質(zhì)量26-27
• 3.2.2 小RNA序列長(zhǎng)度分布27
• 3.2.3 樣品間小RNA公共及特有序列分析27-28
• 3.3 小RNA序列的清理28-30
• 3.3.1 小RNA與重復(fù)序列的比對(duì)28-29
• 3.3.2 小RNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果29-30
• 3.3.3 小RNA序列與Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果30
• 3.4 小RNA的分類注釋30-32
• 3.5 已知miRNA表達(dá)譜信息32-33
• 3.6 新miRNA預(yù)測(cè)信息統(tǒng)計(jì)33-37
• 3.6.1 新miRNA篩選33-35
• 3.6.2 新miRNA的堿基分布統(tǒng)計(jì)35-37
• 3.6.2.1 新miRNA的首位點(diǎn)堿基分布35-36
• 3.6.2.2 新miRNA各位點(diǎn)堿基分布36-37
• 4 討論37-39
• 第三章 差異miRNA的篩選及其qRT-PCR表達(dá)分析39-57
• 1 實(shí)驗(yàn)材料39
• 1.1 植物材料及處理39
• 1.2 主要試劑39
• 1.3 主要儀器設(shè)備39
• 2 實(shí)驗(yàn)方法39-42
• 2.1 不同樣本中差異表達(dá)miRNA的篩選及其表達(dá)模式聚類分析39-40
• 2.1.1 差異表達(dá)miRNA篩選39-40
• 2.1.2 差異表達(dá)miRNA的表達(dá)模式聚類分析40
• 2.2 實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)表達(dá)驗(yàn)證40-42
• 2.2.1 總RNA提取與檢測(cè)40
• 2.2.2 引物設(shè)計(jì)40-41
• 2.2.3 反轉(zhuǎn)錄41-42
• 2.2.4 qRT-PCR表達(dá)分析42
• 2.3 miRNA的表達(dá)模式分析42
• 3 結(jié)果與分析42-55
• 3.1 不同樣本中差異表達(dá)的已知miRNA篩選42-47
• 3.1.1 已知miRNA的差異表達(dá)分析42-45
• 3.1.2 已知miRNA的表達(dá)模式聚類分析45-47
• 3.2 不同樣本中差異表達(dá)的新miRNA篩選47-49
• 3.2.1 新miRNA的差異表達(dá)分析47-48
• 3.2.2 新miRNA的表達(dá)模式聚類分析48-49
• 3.3 miRNA表達(dá)的qRT-PCR驗(yàn)證49-52
• 3.3.1 miRNA和內(nèi)參基因的溶解曲線49-51
• 3.3.2 qRT-PCR表達(dá)驗(yàn)證51-52
• 3.4 miRNA的表達(dá)模式分析52-55
• 4 討論55-57
• 第四章 差異miRNA的功能分析和靶基因預(yù)測(cè)及其表達(dá)分析57-80
• 1 實(shí)驗(yàn)材料57-58
• 1.1 植物材料及處理57
• 1.2 主要試劑與儀器57
• 1.3 數(shù)據(jù)庫(kù)57-58
• 2 實(shí)驗(yàn)方法58-60
• 2.1 miRNA靶基因預(yù)測(cè)58
• 2.2 GO富集分析58-59
• 2.3 KEGG通路分析59
• 2.4 靶基因的qRT-PCR表達(dá)分析59-60
• 2.4.1 總RNA提取與檢測(cè)59
• 2.4.2 引物設(shè)計(jì)59-60
• 2.4.3 反轉(zhuǎn)錄60
• 2.4.4 qRT-PCR表達(dá)分析60
• 3 結(jié)果與分析60-75
• 3.1 miRNA靶基因的預(yù)測(cè)60-62
• 3.2 GO分析62-69
• 3.2.1 已知miRNA靶基因的GO分析62-66
• 3.2.1.1 GO富集倍數(shù)分析62-65
• 3.2.1.2 靶基因的種類和分布65-66
• 3.2.2 新miRNA靶基因的GO分析66-69
• 3.2.2.1 GO富集倍數(shù)分析66-67
• 3.2.2.2 靶基因的種類和分布67-69
• 3.3 KEGG分析69-71
• 3.3.1 已知miRNA靶基因的KEGG分析69-70
• 3.3.2 新miRNA靶基因的KEGG分析70-71
• 3.4 靶基因的qRT-PCR表達(dá)分析71-75
• 3.4.1 靶基因和內(nèi)參基因的溶解曲線71-73
• 3.4.2 qRT-PCR表達(dá)分析73-75
• 4 討論75-80
• 4.1 靶基因的預(yù)測(cè)與功能注釋75-76
• 4.2 抗性相關(guān)代謝途徑分析76-79
• 4.2.1 植物MAPK信號(hào)途徑76-77
• 4.2.2 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑77
• 4.2.3 植物與病原菌互作途徑77-79
• 4.3 部分靶基因的qRT-PCR表達(dá)分析79-80
• 第五章 結(jié)論與展望80-82
• 5.1 結(jié)論80-81
• 5.2 創(chuàng)新點(diǎn)與后續(xù)工作展望81-82
• 參考文獻(xiàn)82-90
• 致謝90

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1 崔洪亮;microRNA的腫瘤表達(dá)研究及協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析[D];中南大學(xué);2014年

2 馬建華;高粱低磷低氮形態(tài)生理特征及低氮響應(yīng)的microRNA研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

3 李虔楨;microRNA相關(guān)基因遺傳多態(tài)性與冠心病臨床關(guān)聯(lián)及預(yù)后研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

4 王耀輝;血清microRNA作為乳腺癌診斷標(biāo)志物的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

5 周霽子;環(huán)境因素對(duì)心臟畸形胎兒影響的表觀遣傳學(xué)機(jī)制[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

6 張麗;microRNA通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)參與血管性認(rèn)知障礙發(fā)生發(fā)展[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

7 查若鵬;肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)microRNA的鑒定及其分子機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

8 方硯田;結(jié)腸癌干細(xì)胞分選、差異microRNA表達(dá)譜檢測(cè)以及miR-449b-CCND1、E2F3通路在結(jié)腸癌干細(xì)胞自我更新的機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

9 辛成齊;椰棗microRNA鑒定及其在果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)譜研究[D];中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所;2015年

10 李棟;先天性心臟病血漿microRNA表達(dá)譜及與GATA4靶序列單核苷酸多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究[D];山東大學(xué);2015年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 高智紅;應(yīng)用多樣性增量方法識(shí)別人類基因組microRNA前體序列[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2010年

2 王娜娜;microRNA進(jìn)化關(guān)系及編碼特性研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2007年

3 王玫;小麥microRNA的鑒定與分析[D];南昌大學(xué);2007年

4 秦保東;原發(fā)性膽汁性肝硬化microRNA表達(dá)譜的檢測(cè)及其功能研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

5 吳曉妍;基于納米復(fù)合材料及生物放大技術(shù)構(gòu)建的電化學(xué)microRNA傳感器的研究[D];西南大學(xué);2015年

6 周景輝;2型糖尿病microRNA表達(dá)譜及其信號(hào)通路研究[D];華南理工大學(xué);2015年

7 姜溪;血漿microRNA-486、microRNA-499在肺癌中的表達(dá)及臨床價(jià)值的研究[D];河北大學(xué);2015年

8 林杉;營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)舍飼綿羊非繁殖季節(jié)發(fā)情相關(guān)microRNA篩選及其靶基因功能驗(yàn)證[D];石河子大學(xué);2015年

9 林妹妹;microRNA-192 和 microRNA-21 在 IBD 患者中的表達(dá)情況[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

10 徐嬌陽;循環(huán)microRNA用于低氧性肺動(dòng)脈高壓早期診斷的實(shí)驗(yàn)研究[D];石河子大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：甘蔗受黑穗病菌脅迫下microRNA差異表達(dá)及其靶基因功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：290380