細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum sensing,QS)是依賴于種群密度的細(xì)菌之間的信息交流。群體感應(yīng)系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)自由生活細(xì)菌的群體行為,也可調(diào)控與宿主之間的相互作用。大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110能與大豆形成根瘤,具有優(yōu)良的共生固氮特性。對該根瘤菌群體感應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行研究,有助于加深對大豆-根瘤菌共生固氮體系的認(rèn)識,為根瘤菌的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù),也對全球氮生態(tài)循環(huán)研究具有重要的意義。本論文以大豆慢生型根瘤菌模式菌株Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110(B.d 110)為研究對象,探究了染色體上LuxI-LuxR型群體感應(yīng)基因blr1062(bjaR1)-blr1063(bjaI)在根瘤菌共生中的生物學(xué)作用。研究結(jié)果如下:1.blr1062調(diào)節(jié)基因與blr1063結(jié)構(gòu)基因作為一個操縱子發(fā)揮功能,相互之間進(jìn)行環(huán)式調(diào)控;blr1063基因的表達(dá)受到大豆金雀異黃酮(Genistein)誘導(dǎo),但是被大豆種子浸提液(SSE)顯著抑制。與野生株相比,blr1062突變株在半固體豐富培養(yǎng)基(YMB)上運(yùn)動性顯著增強(qiáng)48.3%,表明blr1062突變有利于根瘤菌快速在大豆植株根部定殖,以形成根瘤。2.與大豆的接種實驗結(jié)果顯示:與野生株相比,blr1062突變株接種的大豆在側(cè)根上的根瘤數(shù)增加,總根瘤數(shù)與根瘤干重略有提高,固氮酶活性及根系表面積分別顯著增加82.6%和9.9%,表明blr1062的突變有利于結(jié)瘤固氮。這也進(jìn)一步表明,Blr1062可能是作為負(fù)調(diào)控因子參與這些共生固氮過程。3.在綜合文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了B.d 110中參與結(jié)瘤調(diào)控關(guān)鍵基因的lacZ報告基因轉(zhuǎn)錄融合體。相較于野生株,blr1062突變株中參與負(fù)調(diào)控結(jié)瘤數(shù)的nwsA、nolA與nodD2調(diào)控基因,特別是后兩者的表達(dá)顯著降低,而參與結(jié)瘤因子合成的結(jié)構(gòu)基因nodY的表達(dá)顯著增強(qiáng);與此相反,正調(diào)控結(jié)瘤數(shù)的nodD1、nodW等基因的表達(dá)差異不明顯。此外,blr1062的突變降低了三型分泌系統(tǒng)中相關(guān)基因(ttsI與rhcN)的表達(dá),但是差異不明顯。這些結(jié)果表明,群體感應(yīng)系統(tǒng)可能通過NolA以及NodD2參與負(fù)調(diào)控根瘤菌結(jié)瘤過程,這也與接種實驗結(jié)果相一致。4.轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示,上述參與結(jié)瘤調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)與通過lacZ報告基因獲得的結(jié)果基本相一致。此外,blr1062的缺失突變使得KEGG富集中大量參與氮代謝通路上相關(guān)基因的表達(dá)顯著下調(diào)。在添加不同氮源的最小液體培養(yǎng)基中,blr1062突變體菌株與野生體菌株生長呈現(xiàn)明顯差異,表明群體感應(yīng)系統(tǒng)可能參與根瘤菌的氮代謝過程,從而影響固氮酶活性,但是機(jī)理不清楚。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示,盡管差異蛋白的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組獲得的差異基因的結(jié)果并不相關(guān),但是KEGG通路富集中,參與群體感應(yīng)系統(tǒng)的大量基因在翻譯水平顯著上調(diào)。此外,氮代謝過程中,只有谷氨酰胺合成酶與谷氨酸脫氫酶的蛋白表達(dá)顯著下調(diào),并得到酶活性分析的驗證支持。綜合以上結(jié)果,大豆慢生型根瘤菌中的群體感應(yīng)系統(tǒng)可能通過NodD2參與根瘤菌負(fù)調(diào)控結(jié)瘤,并且參與氮代謝過程,從而影響根瘤菌的固氮作用。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S565.1
【部分圖文】：

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobiumdiazoefficiens群體感應(yīng)系統(tǒng)在共生過程中的功能研究2于植物根系，根毛彎曲，隨后根瘤菌侵入根毛。根瘤菌進(jìn)入植物體后，經(jīng)歷一個分化過程，開始表達(dá)固氮酶以及其它固氮所必需的基因，從而給植物提供氮源[5]。根瘤菌與大豆發(fā)生共生結(jié)瘤一般包含以下幾個過程：（1）根瘤菌感知到豆科植物根系分泌到根際的信號分子例如類黃酮化合物（圖1.1a），誘導(dǎo)細(xì)菌調(diào)節(jié)蛋白NodD激活參與菌株特異性信號分子合成的nod（結(jié)瘤）基因轉(zhuǎn)錄（也被稱為Nod因子/NFs）；（2）根瘤菌附著在根毛的頂端，分泌NFs，開啟根瘤發(fā)育過程，包括根毛變形和皮層內(nèi)根瘤原基的形成（圖1.1b）；（3）根毛頂端的根瘤菌進(jìn)入卷曲的根毛中形成感染線，之后在根毛內(nèi)部伸長，穿過多個細(xì)胞層，到達(dá)正在發(fā)育的根瘤原基[6]（圖1.1c-f）；（4）根瘤菌通過一種類似內(nèi)吞作用的機(jī)制侵入植物細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞擴(kuò)大，形成稱為共生體的細(xì)胞器樣結(jié)構(gòu)（圖1.1g）開始固氮[7]；（5）根瘤菌DNA在入侵的植物細(xì)胞中復(fù)制，而被感染的植物細(xì)胞則成為擁有數(shù)千個共生體的大型多倍體細(xì)胞[8]；（6）有限根瘤無持續(xù)的分生組織，變成球狀（圖1.1h-j），成熟的共生體包含多個正常大小的類菌體；（7）根瘤開始從中心衰老，并延伸到周圍[9]，從解體的根瘤菌釋放進(jìn)入下一個生命周期（圖1.1k）。圖1.1有限根瘤形成過程[10]Fig1.1Theprocessoflimitednoduleformation大豆植物與根瘤菌的共生固氮體系具有很高的經(jīng)濟(jì)與生態(tài)效益，共生系統(tǒng)的建立涉及雙方信號物質(zhì)的交流。對共生固氮過程中根瘤菌與大豆如何進(jìn)行信號傳遞，以促進(jìn)雙方的生長與發(fā)展的研究具有重大意義，同時也為進(jìn)一步促進(jìn)綠色農(nóng)業(yè)和生態(tài)文明建設(shè)提供科學(xué)依據(jù)。1.2群體感應(yīng)系統(tǒng)介紹1.2.1細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)細(xì)菌在

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobiumdiazoefficiens群體感應(yīng)系統(tǒng)在共生過程中的功能研究6圖1.2群體感應(yīng)系統(tǒng)中有關(guān)的信號通路[44]Fig1.2Relatedsignalpathwaysinquorumsensingsystem2011年在B.d110中發(fā)現(xiàn)了一處參與群體感應(yīng)信號分子合成的基因位點(diǎn)：bjaI，它的多肽序列與兩種AHL合成酶（BtaI和RpaI）密切相關(guān)，并產(chǎn)生了一種獨(dú)特的高絲氨酸內(nèi)酯（HSL），此信號分子不是BtaI和RpaI產(chǎn)生的芳基-HSL，而是支鏈脂肪�；�-HSL，即異戊酰基高絲氨酸內(nèi)酯（IV-HSL）。參與信號分子合成與調(diào)控基因位點(diǎn)是bjaR1和bjaI（圖1.3）。其中結(jié)構(gòu)基因bjaI（blr1063）是LuxI家族同源物，編碼產(chǎn)生的IV-HSL合成酶不像其他脂肪酰基-HSL合酶選擇�；�-ACP作為活化的脂肪酸底物，而是利用�；�-CoA作為酰基載體，催化合成IV-HSL。因此AHL合成酶亞家族，包括RpaI，BtaI和BjaI[45]。調(diào)節(jié)基因bjaR1（blr1062）是LuxR家族同源物，可與低密度的IV-HSL結(jié)合，激活下游基因表達(dá)。細(xì)菌通常需要納摩級信號濃度[46]來激活下游基因，但B.d110產(chǎn)生的IV-HSL大約是2-10nM，而IV-HSL濃度為10pm就可誘導(dǎo)bjaR1基因的表達(dá)，表明IV-HSL的產(chǎn)生量能夠建立一個群體感應(yīng)信號通路[45]，雖然誘導(dǎo)bjaI表達(dá)的基礎(chǔ)水平低，但通過外源添加IV-HSL可使bjaI基因表達(dá)增強(qiáng)約20倍，并且B.d110不需要外源底物來產(chǎn)生IV-HSL。CarolineS.Harwood等人雖然分離純化了自誘導(dǎo)物IV-HSL，并首次闡明了該位點(diǎn)作為LuxR/LuxI型群體感應(yīng)效應(yīng)系統(tǒng)的一些獨(dú)特性，但是B.d110是共生固氮細(xì)菌，此群體感應(yīng)的兩個基因位點(diǎn)bjaR1（blr1062）-bjaI（blr1063）是否以及如何參與共生沒有研究。因此本文對此位點(diǎn)的基因功能進(jìn)行了探究。

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobiumdiazoefficiens群體感應(yīng)系統(tǒng)在共生過程中的功能研究7圖1.3bjaR1-bjaI基因位點(diǎn)[45]Fig1.3ThegenelocusofbjaR1-bjaI1.3實驗內(nèi)容和目的、意義1.3.1實驗內(nèi)容和目的本研究主要內(nèi)容包括：（1）群體感應(yīng)系統(tǒng)表達(dá)模式分析，blr1062缺失突變對大豆植株的共生固氮影響；（2）利用lacZ報告基因，比較探究blr1062突變株與野生株中，調(diào)控結(jié)瘤基因表達(dá)信號通路上關(guān)鍵基因的表達(dá)模式；（3）利用轉(zhuǎn)錄組與蛋白組學(xué)手段，從全基因組水平，分析blr1062突變帶來的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)變化。研究目的：圍繞參與群體感應(yīng)的兩個基因（blr1062與blr1063），在構(gòu)建缺失突變株基礎(chǔ)上，構(gòu)建功能回復(fù)株及相關(guān)的lacZ融合菌株，探究此基因位點(diǎn)是否影響共生，闡明此位點(diǎn)缺失對于和結(jié)瘤基因有關(guān)的信號通路的影響，同時運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組與蛋白組學(xué)初步挖掘影響共生的機(jī)制。1.3.2研究意義多個國家在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上面臨為提高產(chǎn)量長期使用化學(xué)施肥，造成土壤結(jié)塊、耕地質(zhì)量下降、生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞等一系列問題。為了農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展以及大自然與人的和諧相處[47]，具有高效固氮能力的根瘤菌可應(yīng)用于生產(chǎn)，不僅可以增強(qiáng)大豆結(jié)瘤固氮能力，而且能減少使用氮肥帶來的生態(tài)環(huán)境污染問題。為更好地提高農(nóng)作物產(chǎn)量與質(zhì)量，減少對生態(tài)環(huán)境造成的傷害，許多國家包括中國正致力于研發(fā)高質(zhì)量菌株，促進(jìn)綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展。在根瘤菌中，B.d110由于能與大豆形成根瘤且具有優(yōu)良的共生固氮特性成為最重要的農(nóng)業(yè)物種，被廣泛應(yīng)用于分子遺傳學(xué)和生態(tài)學(xué)。影響根瘤菌和宿主植物相互作用的一個重要因素是群體感應(yīng)系統(tǒng)，長期以來，對于群體感應(yīng)基因的功
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