本文關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒RNA與非結(jié)構(gòu)蛋白互作的研究及nsp12多克隆抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染引起的,給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來了經(jīng)濟(jì)上毀滅性的災(zāi)難。近幾年來,我們對(duì)該病毒編碼的結(jié)構(gòu)蛋白功能已有了突破性的認(rèn)知,但有關(guān)非結(jié)構(gòu)蛋白功能還了解很少。FL12質(zhì)粒包含PRRSV NVSL#97-7895毒株基因組全長(zhǎng)cDNA。本文以FL12質(zhì)粒為模板,通過構(gòu)建pTriEx-nsp12表達(dá)載體,大量表達(dá)病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp12(nsp,nonstructural protein),經(jīng)Ni2+親和層析獲得高純度蛋白,作為制備抗血清的抗原。實(shí)驗(yàn)遵照適合的免疫流程免疫家兔,制備nsp12抗血清。斑點(diǎn)雜交和Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示我們獲得了nsp12的高效價(jià)抗體,并且可以檢測(cè)到nsp12在PRRSV感染的MARC145細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞MA104派生細(xì)胞系)中的表達(dá)。同時(shí)顯微鏡觀察pTriEx-nsp12-GFP質(zhì)粒在293T(人胚腎細(xì)胞派生細(xì)胞系)及MARC145細(xì)胞中的表達(dá)定位情況發(fā)現(xiàn),nsp12主要分布在細(xì)胞質(zhì)的部分區(qū)域,可能定位于某些細(xì)胞器。在對(duì)PRRSV反向遺傳系統(tǒng)構(gòu)建過程中,我們采用兩條策略構(gòu)建感染型的cDNA克隆。pTriEx-FL12質(zhì)粒包含NVSL#97-7895毒株基因組全長(zhǎng)cDNA,克隆在pTriEx1.1載體上。pTriExHH-FL12質(zhì)粒構(gòu)建方法和pTriEx-FL12質(zhì)粒類似,但PRRSV cDNA側(cè)翼添加了核酶序列。遺憾的是,兩種方法構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染均沒有包裝得到病毒。通過對(duì)兩個(gè)改造的質(zhì)粒骨架pTriExHH-linker和pTriEx-linker研究分析發(fā)現(xiàn),缺失5’非翻譯區(qū)的質(zhì)粒不影響蛋白表達(dá)過程中mRNA的轉(zhuǎn)錄,但在多克隆位點(diǎn)插入核酶DNA序列后,由于轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物的自我剪切作用,蛋白表達(dá)量下降。即改造質(zhì)粒可以在細(xì)胞內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄并發(fā)揮核酶的功能。由于設(shè)計(jì)上的缺陷,即使核酶存在的載體在PRRSV的cDNA轉(zhuǎn)錄后,3’非翻譯區(qū)仍然存在少量冗余核苷酸,我們分析這些多余的核苷酸可能影響RdRp(RNA-dependent RNA polymerase)的結(jié)合,阻礙病毒復(fù)制。除此之外,MARC145細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低,也可能導(dǎo)致病毒的包裝效率降低,無法觀察到細(xì)胞病變現(xiàn)象。動(dòng)脈炎病毒基因組5’和3’非翻譯區(qū)在病毒復(fù)制過程中非常重要,例如結(jié)合病毒RNA的聚合酶,解旋酶等。因此,實(shí)驗(yàn)采用體外轉(zhuǎn)錄的方法研究5’和3’非翻譯區(qū)同非結(jié)構(gòu)蛋白之間的互作情況,通過凝膠阻滯電泳確定結(jié)合反應(yīng)是否發(fā)生。其中結(jié)構(gòu)蛋白N是PRRSV核衣殼組分,已經(jīng)確認(rèn)可以結(jié)合病毒RNA,但本實(shí)驗(yàn)使用的N蛋白可能由于GST標(biāo)簽的空間位阻效應(yīng),阻礙N-GST融合蛋白同RNA結(jié)合。nsp9存在RdRp結(jié)構(gòu)域,已經(jīng)確認(rèn)能夠識(shí)別并結(jié)合病毒基因組側(cè)翼非翻譯區(qū),凝膠阻滯電泳也顯示出其有結(jié)合活性。nsp8為病毒ORF1a編碼的最后一個(gè)蛋白,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),加入該蛋白的實(shí)驗(yàn)組無論同病毒3’端還是5’端RNA作用,均會(huì)導(dǎo)致RNA快速降解,這是一個(gè)新穎的發(fā)現(xiàn),推測(cè)nsp8可能具有RNA酶活性。另外,nsp7和nsp12蛋白沒有發(fā)現(xiàn)結(jié)合活性。
【關(guān)鍵詞】：PRRSV 非結(jié)構(gòu)蛋白 多克隆抗體 反向遺傳系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.651
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• abstract7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-22
• 1.1 PRRSV概論12
• 1.2 PRRSV的基因組結(jié)構(gòu)12-18
• 1.2.1 非結(jié)構(gòu)蛋白的種類和功能14-16
• 1.2.2 結(jié)構(gòu)蛋白的種類和功能16-18
• 1.3 PRRSV復(fù)制過程18-19
• 1.4 合成病毒學(xué)的發(fā)展與應(yīng)用19-21
• 1.5 本論文研究的目的及意義21-22
• 第二章 PRRSVnsp12基因的克隆表達(dá)與多克隆抗體的制備22-33
• 2.1 材料與試劑22
• 2.1.1 工程菌株和質(zhì)粒載體22
• 2.1.2 器材與試劑22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法步驟22-26
• 2.2.1 pTriEx-nsp12載體的構(gòu)建22-23
• 2.2.2 nsp12蛋白表達(dá)條件優(yōu)化23-24
• 2.2.3 nsp12的純化24
• 2.2.4 nsp12多克隆抗體的制備24-25
• 2.2.5 斑點(diǎn)雜交對(duì)抗血清效價(jià)的初步檢測(cè)25
• 2.2.6 Western Blot檢測(cè)nsp12原核表達(dá)25
• 2.2.7 Western Blot檢測(cè)nsp12在PRRSV感染的MARC145細(xì)胞中的表達(dá)25
• 2.2.8 融合蛋白nsp12-GFP亞細(xì)胞定位25-26
• 2.3 結(jié)果與分析26-31
• 2.3.1 pTriEx-nsp12質(zhì)粒的構(gòu)建26
• 2.3.2 nsp12蛋白表達(dá)純化26-28
• 2.3.3 免疫血清的檢測(cè)28-29
• 2.3.4 Western Blot檢測(cè)nsp12原核表達(dá)29-30
• 2.3.5 pTriEx-nsp12-GFP亞細(xì)胞定位30
• 2.3.6 nsp12在PRRSV感染的MARC145細(xì)胞中的表達(dá)30-31
• 2.4 討論31-33
• 第三章 PRRSV反向遺傳系統(tǒng)及致弱病毒感染型cDNA克隆的構(gòu)建33-39
• 3.1 材料與試劑33
• 3.1.1 工程菌株和質(zhì)粒載體33
• 3.1.2 器材與試劑33
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法步驟33-36
• 3.2.1 感染型cDNA克隆的構(gòu)建33-36
• 3.2.2 感染型cDNA克隆轉(zhuǎn)染MARC145細(xì)胞包裝病毒36
• 3.3 結(jié)果與分析36-38
• 3.3.1 質(zhì)粒pTriEx-FL12的構(gòu)建36-38
• 3.3.2 質(zhì)粒pTriEx-FL12Δ 的構(gòu)建38
• 3.3.3 pTriEx-FL12和pTriEx-FL12Δ 轉(zhuǎn)染MARC145細(xì)胞38
• 3.4 討論38-39
• 第四章 帶有核酶序列的病毒感染型cDNA克隆的構(gòu)建39-45
• 4.1 材料與試劑39
• 4.1.1 工程菌株和質(zhì)粒載體39
• 4.1.2 器材與試劑39
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法步驟39-41
• 4.2.1 pTriExHH-FL12質(zhì)粒的構(gòu)建39-41
• 4.2.2 pTriExHH-FL12轉(zhuǎn)染MARC145細(xì)胞包裝病毒41
• 4.2.3 pTri ExHH-linker-GFP和pTriEx-linker-GFP載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的GFP熒光檢測(cè)41
• 4.3 結(jié)果與分析41-43
• 4.3.1 質(zhì)粒pTriExHH-linker的構(gòu)建41-42
• 4.3.2 質(zhì)粒pTriExHH-FL12的構(gòu)建42
• 4.3.3 pTriExHH-FL12轉(zhuǎn)染MARC145細(xì)胞包裝病毒42
• 4.3.4 pTriExHH-linker-GFP和pTriEx-linker-GFP質(zhì)粒真核細(xì)胞表達(dá)GFP顯微觀察42-43
• 4.4 討論43-45
• 第五章 PRRSV5’UTR和 3’UTR與非結(jié)構(gòu)蛋白之間的互作45-50
• 5.1 材料與試劑45
• 5.1.1 工程菌株和質(zhì)粒載體45
• 5.1.2 器材與試劑45
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法步驟45-47
• 5.2.1 PRRSV3’非翻譯區(qū)質(zhì)粒載體的構(gòu)建45-46
• 5.2.2 非結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)純化46
• 5.2.3 PRRSV的 5’和 3’非翻譯區(qū)同非結(jié)構(gòu)蛋白的互作46-47
• 5.3 結(jié)果與分析47-48
• 5.3.1 非結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)純化47
• 5.3.2 pTriEx-3EMSA質(zhì)粒載體的構(gòu)建47-48
• 5.3.3 凝膠阻滯電泳檢測(cè)PRRSV 5’和 3’非翻譯區(qū)同非結(jié)構(gòu)蛋白的互作48
• 5.4 討論48-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-60
• 附錄 160-61
• 附錄 261-63
• 附錄 363-64
• 致謝64-65
• 作者簡(jiǎn)介65

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