適宜的開花時間對于植物的生殖生長及其產(chǎn)品器官的產(chǎn)量和品質(zhì)非常重要,因此植物進化出復(fù)雜且精細的調(diào)控機制來調(diào)控開花時間。芥菜(Brassica juncea Coss)是十字花科蕓薹屬蔬菜,起源于亞洲,在我國南方大面積種植。因此,芥菜開花時間基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究,對于生產(chǎn)指導(dǎo)和科學(xué)研究都有非常重要的意義。近30年對模式植物擬南芥基因的研究表明開花遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由6個途徑相互作用調(diào)控：光周期途徑,自主途徑,春花途徑,赤霉素途徑,環(huán)境溫度途徑,年齡途徑。這六個途徑主要由一些開花整合子基因調(diào)控,這些基因編碼不同的蛋白,通過整合多個途徑中的信號從而調(diào)控開花時間,例如開花信號整合子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1 (SOC1),它能夠整合低溫春化途徑核心調(diào)控因子FLOWERING LOCUS C (FLC和光周期途徑核心調(diào)節(jié)因子SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP)的開花信號。但是,芥菜SOCl基因是否受到FLC和SVP蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控?FLC和SVP蛋白能否直接結(jié)合到SOCl基因啟動子上抑制SOCl基因的表達?目前并不清楚。本試驗以芥菜為研究材料,根據(jù)SOCl已知基因序列設(shè)計特異性引物,利用染色體步移法克隆出SOCl的啟動子,并且利用生物信息學(xué)分析啟動子的關(guān)鍵調(diào)控元件。構(gòu)建SOCl啟動子及SVP、FLC的酵母單雜交重組表達載體,通過酵母單雜交系統(tǒng)進一步鑒定及分析SOCl啟動子與SVP、FLC蛋白相互作用,以期為SOC1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等深入研究奠定基礎(chǔ)。1、SOC1啟動子的克隆及生物信息學(xué)分析提取芥菜基因組DNA,根據(jù)芥菜SOC1已知基因序列設(shè)計特異性引物,利用染色體步移法從芥菜gDNA中克隆出未知SOCl啟動子序列。獲得的SOC1啟動子為782bp,進化分析表明芥菜SOCl的啟動子與擬南芥SOCl的啟動子關(guān)系最近,與高山南芥SOCl的啟動子親緣關(guān)系最遠。對其順式元件生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),該序列中含有TATA-box核心啟動子元件、CAAT-box等上游啟動子元件以及多種應(yīng)答元件。2、SOC1的啟動子克隆與FLC、SVP蛋白相互作用的檢測設(shè)計帶有HindⅢXhoⅠ酶切位點的引物,亞克隆SOC1的啟動子基因序列。構(gòu)建SOC1啟動子、SVP. FLC的酵母表達載體pAbAi-SOC1、pGADT7-FLC、 pGADT7-SVP。利用酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)操作手冊將線性化的酵母重組質(zhì)粒pAbAi-SOC1轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細胞中,得到相應(yīng)的酵母轉(zhuǎn)化子YIH (pAbAi-SOC1)。SD/-Ura平板上30℃倒置培養(yǎng)3-5d,發(fā)現(xiàn)酵母轉(zhuǎn)化子能夠正常生長,表明線性化pAbAi-SOC1重組質(zhì)粒已成功導(dǎo)入酵母基因組中。進一步在SD/-Ura/AbA*缺陷培養(yǎng)基上篩選AbA抗性濃度,結(jié)果表明AbA100ng/ml下,假陽性就能夠很好地被抑制。然后進行二次轉(zhuǎn)化,將pGADT7-FLC、pGADT7-SVP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Y(jié)1H(pAbAi-SOC1)酵母感受態(tài)細胞中,發(fā)現(xiàn)YIH (pAbAi-SOC1×pGADT7-FLC)、YIH (pAbAi-SOC1 ×pGADT7-SVP)都能在SD/-Leu/AbA100上正常生長,結(jié)果說明克隆得到的芥菜SOCl啟動子能夠與FLC、SVP蛋白發(fā)生相互作用,為進一步研究它們的作用位點提供了基礎(chǔ)。3、SOC1啟動子與FLC、SVP蛋白相互作用關(guān)鍵區(qū)域的預(yù)測在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn),MADS-box蛋白會特異性結(jié)合到CArG-box (MADS蛋白結(jié)合元件)上,從而激活或抑制下游基因的表達。SVP、FLC蛋白屬于MIKC型MADS-box蛋白,因此我們分析了SOC1啟動子序列,并沒有發(fā)現(xiàn)與擬南芥SOC1啟動子中序列完全一致的CArG-box,但是找到了三個類似的CArG-box,并推測這三個位點可能是SOC1基因的啟動子與SVP、FLC蛋白的相互作用位點。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S637;Q943.2
【部分圖文】：

第〗章文獻綜述???ＤＳ－ｂｏｘ蛋白復(fù)合物的形成和激活轉(zhuǎn)錄的作用［５１］。但是，在擬南芥ＳＥＰ３蛋白的??宄中發(fā)現(xiàn)，Ｃ域的有無對多聚化影響不大，而在Ｃ域缺失時，Ｋ３子域?qū)Χ嗑刍??著重要的作用［５２］。??ＭＩＫＣ型蛋白含有多種蛋白與蛋白相互作用的基序（這些基序?qū)λ姆肿踊钚??關(guān)鍵），與其他調(diào)節(jié)蛋白共享其分子結(jié)構(gòu)。ＭＩＫＣ型蛋白二聚體和高級復(fù)合物提??了一個增強功能特異性的理想模型，這反映在不同的復(fù)合體對ＤＮＡ的不同綁定??力［５３］。被子植物的ＭＡＤＳ蛋白參與調(diào)控多種發(fā)育過程，如幵花時間、花分生組??特性，果實發(fā)育等。??

出３條退火溫度較高，ＧＣ含量在４５？５５％，長度為２２？２６ｎｐ的特異性引物（ＳＰ１，??ＳＰ２，?ＳＰ３）。設(shè)計引物的方向為未知序列方向，ＳＰ２應(yīng)設(shè)計在ＳＰ１的內(nèi)側(cè)，ＳＰ３在??ＳＰ２的內(nèi)側(cè)（圖１－２）。特異性引物與位于未知序列的４個隨機簡并引物（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ??Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ?Ｐｒｉｍｅｒ，?ＡＰ）形成弓丨物對，經(jīng)過３次巢式ＰＣＲ?（ｎｅｓｔｅｄ?ＰＣＲ）后獲得目??６??

在酵母單雜交體系中，將ＧＡＬ４的ＤＮＡ結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為其它蛋白，并且用??特異的ＤＮＡ序列（Ｂａｉｔ）取代ＧＡＬ４的ＤＮＡ結(jié)合位點，該ＤＮＡ序列在相關(guān)生物??系統(tǒng)中是重要的蛋白質(zhì)結(jié)合位點（如圖１－３）。目標ＤＮＡ序列特異的結(jié)合蛋白（Ｐｒｅｙ）??與ＧＡＬ４的激活結(jié)構(gòu)域可融合形成融合體，Ｐｒｅｙ與其特異性ＤＮＡ結(jié)合位點之間通??過相互作用可激活作為表型選擇性標志的報告基因ＡｂＡ■■的表達［８１］。理論上，酵母??單雜交體系可利用祀ＤＮＡ序列，捕獲具有與該元件特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。??該體系不僅適用于識別轉(zhuǎn)錄因子，也適用于研究參與轉(zhuǎn)錄抑制和ＤＮＡ復(fù)制過程的??蛋白質(zhì)。??１１??
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 趙學(xué)彬;唐桂英;單雷;;植物Ⅱ型啟動子功能研究的常用方法及其進展[J];生命科學(xué);2013年06期

2 楊曉娜;趙昶靈;李云;李會容;蘇麗;周燕瓊;;啟動子序列克隆和功能分析方法的研究進展[J];云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2010年02期

本文編號：2881846