隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展,植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在基因功能研究和轉(zhuǎn)基因新品種培育方面具有非常重要的意義。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已廣泛用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化,改善植物對生物和非生物脅迫的耐受能力,改善養(yǎng)分捕獲和抗蟲抗病能力,提高作物生產(chǎn)力并減少有害農(nóng)藥的使用。本研究以核桃幼胚為外植體,對從幼胚誘導(dǎo)體胚以及體胚成熟與萌發(fā)的條件進(jìn)行了優(yōu)化;采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將JrWRKY4基因轉(zhuǎn)入核桃體胚。研究核桃體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)基因體系構(gòu)建的優(yōu)化條件,為核桃基因功能分析和轉(zhuǎn)基因育種奠定了基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1.本實(shí)驗以核桃幼胚子葉為外植體,誘導(dǎo)體胚分化、成熟,并獲得再生植株。通過體胚形成和發(fā)育過程的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)觀察,揭示了核桃體胚發(fā)育的球形期、心形期、魚雷形期、子葉期等過程的結(jié)構(gòu)變化,明顯觀察到體胚的極性發(fā)育過程,與合子胚形成過程相似。觀察到球形期中內(nèi)層細(xì)胞分裂成基礎(chǔ)的維管組織,魚雷型期中原形成層已發(fā)育,清晰地看到極性的逐步建立,子葉形期中清楚的觀察到Y(jié)型維管束等過程。2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的核桃體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)基因體系構(gòu)建:選取長勢良好的未轉(zhuǎn)化的核桃體細(xì)胞胚,為了能達(dá)到篩選效果,遺傳轉(zhuǎn)化的抗生素選擇壓為50mg·L~(-1)的卡那霉素;通過優(yōu)化體胚轉(zhuǎn)基因條件,農(nóng)桿菌菌液濃度OD_(600)=0.6,侵染時間為20min,共培養(yǎng)1 d,抑菌劑羧芐青霉素濃度為250 mg·L~(-1),將PRI101-JrWRKY4轉(zhuǎn)入核桃體胚。3.經(jīng)過卡那抗性篩選的體胚,用PCR檢測能擴(kuò)增出約1554bp的條帶;對轉(zhuǎn)基因體胚中JrWRKY4基因的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR檢測,JrWRKY4基因在核桃轉(zhuǎn)基因體胚中的表達(dá)量與未轉(zhuǎn)化的體胚相比明顯上升,轉(zhuǎn)基因體胚中JrWRKY4基因的表達(dá)量是未轉(zhuǎn)化體胚表達(dá)量的近10倍;對已轉(zhuǎn)化的體胚進(jìn)行Western Blot檢測,可檢測到約90KD的目的條帶。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S664.1
【部分圖文】：

，2011）。李迎超（2010）以“綠嶺”核桃為試材，通過顯微觀察、運(yùn)用石蠟切片和組織培養(yǎng)技術(shù)，觀察了“綠嶺”核桃的開花物候期和雌花開放過程，調(diào)查了雌花套袋、切柱頭和聚乙烯醇封柱頭3種處理方法的核桃無融合生殖坐果情況，并對無融合生殖過程中胚珠、胚囊和胚胎的發(fā)育以及果實(shí)性狀、胚的倍性進(jìn)行了研究。張啟香以自然授粉后的山核桃幼胚為外植體再生出完整植株，并且對其發(fā)育過程進(jìn)行了組織細(xì)胞學(xué)觀察（張啟香，2011）。盡管體細(xì)胞胚發(fā)生已經(jīng)在許多木本物種中廣泛使用，但繁殖成年木本植物仍然很困難（GuanY，2016）。圖1.1山核桃體胚發(fā)生期的組織細(xì)胞學(xué)觀察（張啟香，2011）Fig1.1histocytologicalobservationofsomaticembryogenesisofpecan(qixiangzhang,2011)

合∈?000倍，適量，加至上膜中，4℃孵育8h；3）一抗稀釋液倒回原處（可低溫下保存），PBST的緩沖液沖洗該膜5次，每次4min左右。4）抗體稀釋液稀釋二抗2000倍使用，4℃，孵育3-4h。5）二抗稀釋液倒至原處，4）中緩沖液洗此膜6次，每次4min。6）顯影：顯影液加至PVDF膜，使用BIO-RAD蛋白成像儀顯影，拍照且保存圖片。3結(jié)果與分析3.1核桃體胚形態(tài)學(xué)及組織細(xì)胞學(xué)觀察1.以核桃優(yōu)株B26幼胚的子葉為外植體，取長度約5mm，通過再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基DKW+1mg·L-16-BA+0.1mg·L-1IBA+2mg·L-1KT，誘導(dǎo)分化出核桃初代體細(xì)胞胚（如圖3.1-2）；選取長勢良好的初代體細(xì)胞胚在增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖，實(shí)驗所用的培養(yǎng)基為DKW+30g蔗糖+7g瓊脂，每個培養(yǎng)基接種4~8個初代體細(xì)胞胚，接種后每周轉(zhuǎn)移一次至新鮮培養(yǎng)基。暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22±1℃，7-14d得到次生胚及胚性愈傷（如圖3.1-3和圖3.1-4）；選取長勢良好的次生胚，接種到生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基DKW+15g蔗糖+7g瓊脂+2mg·L-1GA3，光照培養(yǎng)14-30d誘導(dǎo)生根（如圖3.2）。觀察到從體細(xì)胞胚發(fā)育成完整植株的過程。（圖3.1和3.2）。圖3.1體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)分化Fig.3.1differentiationofsomaticembryos注：1為核桃子葉；2為子葉分化出初生體細(xì)胞胚；3、4為初生體細(xì)胞胚的增殖分化Note:1iswalnutcotyledon;2.Cotyledonsdifferentiateintoprimarysomaticembryos;3and4aretheproliferationanddifferentiationofprimarysomaticembryos

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文21圖3.2體細(xì)胞胚各發(fā)育期Fig3.2developmentstagesofsomaticembryos2.核桃次生胚是通過表皮單細(xì)胞起源方式產(chǎn)生的，通過體細(xì)胞胚的解剖學(xué)處理，對其進(jìn)行了組織細(xì)胞學(xué)觀察，觀察到體胚的球形期、心形期、魚雷形期、子葉期（圖3.3），明顯觀察到核桃體胚為極性發(fā)育。圖3.3-1為球形期，內(nèi)層細(xì)胞分裂成基礎(chǔ)的維管組織；圖3.3-3為魚雷型期，其中原形成層已發(fā)育，能夠清晰地看到極性的逐步建立；圖3.3-4為子葉形期，已經(jīng)能夠清楚的觀察到Y(jié)型維管束。圖3.3體細(xì)胞胚切片觀察注：1.球形期晚期；2.早期心形期；3.魚雷形期；4.子葉形期Fig3.3observationofsomaticembryoslicesNote:1.Latesphericity;2.2.Earlyheart-shapedperiod;3.Torpedoshapedperiod;Cotyledonstage3.2體胚抗生素選擇壓的確定如圖3.4所示，Kan會抑制未轉(zhuǎn)化體胚的增殖，隨著Kan濃度的增加，體胚增殖率不斷下降。將生長良好的未轉(zhuǎn)化體胚接種到含不同濃度Kan的培養(yǎng)基上，14d后觀察到各培養(yǎng)基上體胚生長狀況不同。在Kan濃度為0mg·L-1的培養(yǎng)基中，體胚的增殖率為90％；當(dāng)Kan濃度為25mg·L-1時，體胚增殖率68%；當(dāng)Kan濃度為50mg·L-1時，有褐化現(xiàn)象出現(xiàn)（如圖3.5），生成少數(shù)次生胚，體胚的增殖率為38%（圖3.4）；當(dāng)Kan濃度大于或等于75mg·L-1時，體胚不能正常增殖，體胚大小無變化，最終多褐化死亡。為
【參考文獻(xiàn)】

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