馬鈴薯是世界上重要的糧食作物之一,種質(zhì)資源的安全保存是馬鈴薯種質(zhì)利用、新基因挖掘、優(yōu)異品種育種等產(chǎn)業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)。已采用多種保存形式進(jìn)行馬鈴薯種質(zhì)的保存,如田間圃位保存、試管苗保存、超低溫保存等。超低溫保存是無性繁殖作物種質(zhì)長期安全保存的重要方法,研發(fā)優(yōu)化的玻璃化等超低溫保存技術(shù)已用于馬鈴薯超低溫保存,但超低溫保存機(jī)理研究較少。本研究以馬鈴薯品種“呼自81-213”、“Q 504”和“克新4號”試管苗莖尖為試驗(yàn)材料,采用小滴玻璃化法超低溫保存,通過對關(guān)鍵步驟莖尖恢復(fù)培養(yǎng),分析超低溫保存關(guān)鍵步驟對莖尖成活率的影響；利用優(yōu)化的2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)染色條件對莖尖進(jìn)行活力染色,觀察關(guān)鍵步驟的莖尖細(xì)胞存活模式；采用差示掃描量熱分析和超低溫電鏡掃描觀察技術(shù)探討超低溫關(guān)鍵步驟馬鈴薯莖尖細(xì)胞水分變化。以期從超低溫保存關(guān)鍵步驟莖尖細(xì)胞的存活模式和水分變化角度揭示莖尖細(xì)胞的損傷和存活機(jī)理,主要研究結(jié)果如下：1.新鮮莖尖和蔗糖預(yù)培養(yǎng)后莖尖直接恢復(fù)培養(yǎng)成活率為100%,PVS2處理30 min和60 min后莖尖成活率下降。液氮保存后,莖尖經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)后成活率繼續(xù)降低,且PVS2處理30 min的莖尖成活率低于PVS2處理60 min的莖尖成活率。2.馬鈴薯莖尖TTC活力染色條件的優(yōu)化結(jié)果表明,40℃下染色2h為最佳染色條件。利用優(yōu)化的TTC活力染色條件,對3個馬鈴薯品種小滴玻璃化超低溫保存關(guān)鍵步驟處理的莖尖進(jìn)行TTC活力觀察。研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)蔗糖預(yù)培養(yǎng)(MS培養(yǎng)液添加0.3 mol/L和0.5 mol/L蔗糖)的莖尖與新鮮莖尖均保持較高活力；經(jīng)PVS2處理后莖尖表現(xiàn)時空特異性活力喪失和存活,分生組織和葉原基中間區(qū)域仍保持較高活力。通過對莖尖TTC活力染色面積測定,發(fā)現(xiàn)當(dāng)莖尖TTC活力染色面積比≥0.4時,TTC活力染色與恢復(fù)培養(yǎng)存活率呈現(xiàn)極顯著相關(guān)(P0.01)。且面積比≥0.45時的染色率更接近莖尖成活率。3.馬鈴薯莖尖熱力學(xué)分析和超低溫掃描電鏡觀察結(jié)果表明,與新鮮莖尖相比,蔗糖預(yù)培養(yǎng)和PVS2保護(hù)劑處理后,莖尖含水量逐漸降低,恢復(fù)培養(yǎng)4d后莖尖含水量恢復(fù)至新鮮莖尖含水量水平；新鮮莖尖、預(yù)培養(yǎng)后莖尖和恢復(fù)培養(yǎng)4d后莖尖內(nèi)含結(jié)晶水,經(jīng)超低溫掃描電鏡分析時有冰晶形成,經(jīng)PVS2處理的莖尖細(xì)胞呈現(xiàn)了玻璃化狀態(tài)。綜上所述,在馬鈴薯小滴玻璃化法超低溫保存過程中,莖尖分生組織出現(xiàn)了時空特異性活力喪失和存活,PVS2處理是莖尖超低溫保存關(guān)鍵步驟,莖尖通過PVS2保護(hù)處理降低含水量,形成玻璃化狀態(tài)避免冰晶形成。
【學(xué)位單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S532
【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 植物種質(zhì)資源離體保存的現(xiàn)狀及意義
    1.2 馬鈴薯種質(zhì)資源保存的現(xiàn)狀及意義
        1.2.1 田間圃位保存
        1.2.2 試管苗保存
        1.2.3 超低溫保存
    1.3 植物種質(zhì)資源超低溫保存研究
        1.3.1 超低溫保存的理論基礎(chǔ)
        1.3.2 植物超低溫保存結(jié)果評價(jià)
        1.3.3 植物超低溫保存相關(guān)機(jī)理研究
    1.4 國內(nèi)外馬鈴薯種質(zhì)資源超低溫保存研究
        1.4.1 國外馬鈴薯種質(zhì)資源超低溫保存研究
        1.4.2 我國馬鈴薯種質(zhì)資源超低溫保存研究
    1.5 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
    2.2 技術(shù)路線
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 組培苗培養(yǎng)
        2.3.2 超低溫保存流程
        2.3.3 TTC活力染色
        2.3.4 差示掃描量熱儀分析
        2.3.5 超低溫掃描電鏡
        2.3.6 數(shù)據(jù)分析
3 結(jié)果分析
    3.1 超低溫保存關(guān)鍵步驟對馬鈴薯莖尖成活率的影響
    3.2 TTC染色結(jié)果分析
        3.2.1 馬鈴薯莖尖TTC活力染色條件優(yōu)化
        3.2.2 馬鈴薯莖尖超低溫保存過程TTC活力染色結(jié)果分析
    3.3 小滴玻璃化法超低溫保存過程中DSC熱力學(xué)分析
        3.3.1 莖尖含水量變化
        3.3.2 莖尖熱力學(xué)指標(biāo)
    3.4 馬鈴薯莖尖超低溫保存Cryo-SEM顯微觀察
4 結(jié)論與討論
    4.1 小滴玻璃化法超低溫保存關(guān)鍵步驟馬鈴薯莖尖存活模式
    4.2 小滴玻璃化法超低溫保存流程中馬鈴薯莖尖的DSC熱力學(xué)指標(biāo)
    4.3 小滴玻璃化法超低溫保存流程中馬鈴薯莖尖結(jié)構(gòu)Cryo-SEM觀察
本研究的創(chuàng)新點(diǎn)及后續(xù)研究
參考文獻(xiàn)
附錄
    1 縮略詞表
    2 主要儀器設(shè)備
致謝
研究生期間發(fā)表論文

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本文編號：2871045