哺乳動物的生殖主要是由下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸驅(qū)動和引導(dǎo)的,促性腺激素釋放激素(GnRH)被廣泛認(rèn)為是調(diào)控生殖的下丘腦肽。鑒于GnRH對腺垂體性腺激素分泌過程具有重要的調(diào)控作用,已有人工合成的GnRH類似物應(yīng)用于動物的繁殖調(diào)控和多種生殖疾病的臨床治療。GnRH類似物與前列腺激素(PG)聯(lián)合處理是我國常用的牛同期發(fā)情技術(shù),GnRH類似物通過促進(jìn)FSH和LH釋放并作用于卵巢,誘導(dǎo)卵泡發(fā)育以及促進(jìn)排卵,完成同期發(fā)情-定時輸精,提高受胎率。戈那瑞林是人工合成的GnRH,應(yīng)用戈那瑞林進(jìn)行同期發(fā)情處理可以大大降低生產(chǎn)實踐中激素使用的成本,并且有助于進(jìn)一步研究GnRH類似物對FSH的具體調(diào)控機(jī)制。miRNA是一種內(nèi)源性非編碼RNA,研究表明miRNA在各種生理活動調(diào)控和癌癥進(jìn)程中都發(fā)揮關(guān)鍵作用,可參與多種激素的分泌調(diào)節(jié)過程。然而,miRNA是否參與GnRH對FSH的分泌調(diào)控過程,進(jìn)而影響哺乳動物的生殖仍然是未知的,具有重要的研究價值。本研究通過對30頭母牛進(jìn)行GnRH類似物(戈那瑞林)和PG聯(lián)合處理,使之同期發(fā)情。檢測GnRH類似物處理前后母牛卵泡發(fā)育、FSH和LH的分泌變化,發(fā)現(xiàn)GnRH類似物(戈那瑞林)參與FSH分泌的調(diào)控,誘導(dǎo)卵巢上卵泡發(fā)育。為進(jìn)一步探索這種調(diào)控作用的分子機(jī)制,應(yīng)用生物信息學(xué)軟件和雙熒光素酶報告系統(tǒng)預(yù)測可能參與調(diào)節(jié)FSH分泌的miRNA,然后在大鼠原代腺垂體細(xì)胞上進(jìn)行體外驗證,通過轉(zhuǎn)染miR-488的模擬物和抑制劑后進(jìn)行RTq-PCR、elisa等檢測實驗,證明了miR-488與FSH的靶向作用關(guān)系,并且驗證了GnRH與miR-488的作用關(guān)系。結(jié)果表明:1.母牛經(jīng)GnRH類似物處理后,FSH和LH分泌水平顯著上升,促進(jìn)牛的卵巢上卵泡發(fā)育。牛注射戈那瑞林后,在垂體中FSHb和LHb的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。利用Targetscan等預(yù)測軟件,結(jié)合雙熒光素酶報告篩選GnRH類似物處理后差異表達(dá)的miRNA,預(yù)測miR-488可能靶向調(diào)節(jié)FSHb基因。2.大鼠進(jìn)行GnRH類似物處理后,FSH和LH分泌量顯著增多,且FSHb mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào),miR-488-3p表達(dá)水平顯著下調(diào)。miR-488-3p在大鼠性成熟前后差異表達(dá),可能參與生殖調(diào)控。體外驗證miR-488-3p可以靶向調(diào)節(jié)FSHb基因,進(jìn)而影響FSH分泌。綜上所述,本研究分析了GnRH類似物處理后的促卵泡素和促黃體素分泌變化情況,確定了同期發(fā)情程序,解析GnRH類似物通過miR-488調(diào)控FSH分泌的分子機(jī)制,為完善牛發(fā)情控制的處理程序提供理論依據(jù),促進(jìn)激素制品的國產(chǎn)化應(yīng)用。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S823
【部分圖文】：

第一篇文獻(xiàn)綜述第1章GnRH及其類似物的研究進(jìn)展8圖1.1.GnRH調(diào)控FSHb轉(zhuǎn)錄的信號通路模型[62]Fig1.1SignalpathwaymodelofGnRHregulatingFSHbtranscription總之GnRH根據(jù)其不同的脈沖模式（幅度和頻率），可以激活復(fù)雜的信號傳遞通路差異調(diào)節(jié)促性腺激素mRNA的表達(dá)[63,64]，進(jìn)而影響促性腺激素的分泌，調(diào)控動物的生長繁殖。1.4GnRH類似物研究進(jìn)展促性腺激素釋放激素（GnRH）是在下丘腦神經(jīng)元的細(xì)胞體中合成的由十個氨基酸殘基組成的十肽，也稱為促黃體生成激素釋放激素（LHRH）或下丘腦介導(dǎo)雄性和雌性生殖調(diào)控的神經(jīng)肽[65]。由于這種神經(jīng)肽首先在哺乳動物（豬和羊）中被發(fā)現(xiàn)，也被稱為哺乳動物GnRH（mGnRH）[43]，由于天然GnRH的效力低且半衰期短，但具有重要的作用功能，因此開發(fā)了長期有效的GnRH類似物來進(jìn)行臨床治療或?qū)嵺`應(yīng)用[66]。GnRH類似物包括GnRH激動劑和GnRH拮抗劑。促性腺激素釋放激素激動劑是從天然的促性腺激素釋放激素中衍生出來的，其方法是在天然GnRH十肽的第6位上將L-氨基酸用D-氨基酸取代，增加其半衰期和受體占用時間[67]。目前已研究出多種GnRH激動劑，其中代表性的幾種分別是戈舍瑞林，亮丙瑞林，那

第二篇研究內(nèi)容第1章GnRH類似物處理同期發(fā)情對牛FSH及卵泡發(fā)育變化影響28圖1.1GnRH類似物處理后腺垂體中FSH和LH激素分泌量Fig.1.1ThesecretionofFSHandLHhormonesinadenohypophysisafterGnRHanaloguetreatment注：（A）elisa檢測母牛GnRH同期發(fā)情前后FSH分泌量。（B）elisa檢測母牛GnRH同期發(fā)情前后LH分泌量。每個實驗至少重復(fù)三次。顯示了數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。進(jìn)行單因素方差分析和卡方檢驗以評估統(tǒng)計學(xué)顯著性。*表示各組之間存在顯著差異（P<0.05）。Note:(A)TheFSHsecretionwasmeasuredviaELISAbeforeandafterGnRHSynchronousestrus.(B)TheLHsecretionwasmeasuredviaELISAbeforeandafterGnRHSynchronousestrus.Repeateachexperimentatleastthreetimes.Showsthemeanandstandarddeviation(SD)ofthedata.OnewayANOVAandchisquaretestwereusedtoevaluatethestatisticalsignificance.*Indicatesasignificantdifference(P<0.05)1.2.2GnRH類似物對牛卵泡發(fā)育的影響為了探究GnRH處理是否能夠促進(jìn)母牛的發(fā)情以及其對母牛卵巢卵泡發(fā)育的影響，本研究中我們選擇了30頭不含優(yōu)勢卵泡，處于發(fā)情間期的母牛，進(jìn)行GnRH同期發(fā)情處理后，應(yīng)用B型超聲波診斷儀對母牛的卵巢卵泡發(fā)育情況進(jìn)行檢測，將探頭經(jīng)直腸伸入到達(dá)卵巢位置，觀察卵巢形態(tài)，測量卵泡直徑大小，以卵泡最大垂直線的平均值為卵泡直徑，統(tǒng)計30頭母牛第二次注射GnRH后的卵泡發(fā)育情況為下表1.7所示，在GnRH同期發(fā)情處理后卵泡直徑的平均值達(dá)到了1.14cm，說明絕大部分卵泡顯著發(fā)育。這些結(jié)果顯示，隨著母牛FSH和LH的激素分泌量的增加促進(jìn)了卵巢上的卵泡發(fā)育和優(yōu)勢卵泡的形成，即GnRH類似物

第二篇研究內(nèi)容第1章GnRH類似物處理同期發(fā)情對牛FSH及卵泡發(fā)育變化影響30圖1.2GnRH類似物處理前后腺垂體中FSHb和LHbmRNA表達(dá)水平Fig.1.2ExpressionofFSHbandLHbmRNAinadenohypophysisbeforeandafterGnRHanaloguetreatment注：（A）RT-qPCR方法檢測牛腺垂體中FSHbmRNA在GnRH同期發(fā)情處理后的表達(dá)。（B）RT-qPCR方法檢測牛腺垂體中LHbmRNA在GnRH同期發(fā)情后的表達(dá)。每個實驗至少重復(fù)三次。顯示了數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。進(jìn)行單因素方差分析和卡方檢驗以評估統(tǒng)計學(xué)顯著性。*表示各組之間存在顯著差異（P<0.05）。Note:(A)RT-qPCRwasusedtodetecttheexpressionofFSHbmRNAinbovineadenohypophysisafterSynchronousestrusofGnRH.(B)RT-qPCRwasusedtodetecttheexpressionofLHbmRNAinbovineadenohypophysisafterSynchronousestrusofGnRH.Repeateachexperimentatleastthreetimes.Showsthemeanandstandarddeviation(SD)ofthedata.OnewayANOVAandchisquaretestwereusedtoevaluatethestatisticalsignificance.*Indicatesasignificantdifference(P<0.05).1.2.4預(yù)測篩選與牛腺垂體FSHb具有靶向作用的miRNA為進(jìn)一步探索GnRH類似物對促卵泡素的調(diào)控機(jī)制，我們通過TargetScan預(yù)測網(wǎng)站（http://www。targetscan。org/）獲取與靶基因FSHb具有潛在結(jié)合作用的miRNA，通過篩選驗證，選擇具有高保守序列的miR-488-3p，其和FSHb3"UTR之間互補(bǔ)序列的信息（圖1.3A）。然后，為進(jìn)一步證實miR-488-3p靶向FSHb，我們通過雙熒光素酶報告進(jìn)行驗證（圖1.3B）。我們首先將靶基因FSHb與miR-488-3p的結(jié)合序列直接合成后克隆至雙熒光素酶報告載體中，克隆位置位于載體中海腎熒光素酶報告基因的3’UTR區(qū)域，構(gòu)建了FSHb-3"UTR-WT質(zhì)粒（圖1.3C）。最后，將構(gòu)建的質(zhì)粒與miR-488
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