大白菜是十字花科蕓薹屬植物,最早起源于中國,是中國種植面積最大的蔬菜作物,在人民的生活中有十分巨大的食用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值。十字花科根腫病是由根腫菌Plasmodiophora brasicae Woronin引起的一種土傳病害,對各種十字花科作物有致命的傷害,是世界上對蕓薹作物的重要疾病之一。該病傳播迅速,目前對各種各樣的十字花科蔬菜生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅,尤其是對大白菜的品質(zhì)及產(chǎn)量影響非常巨大。隨著我國大白菜種植面積的增加,根腫病的侵害也越來越嚴(yán)重,挖掘新的抗性基因,轉(zhuǎn)育出新的抗病品種是目前最有效的也是最直接的防治根腫病的方式。經(jīng)過數(shù)年的接種鑒定,CR026是對根腫病有非常良好的抗性的大白菜品種,為了明確其抗病基因,開發(fā)連鎖標(biāo)記,本研究用高感大白菜自交品種17A12A與CR026進(jìn)行雜交得到F_1代,經(jīng)過F_1代自交得到F_2代,對F_2代進(jìn)行接菌鑒定,選擇20棵極端抗病單株,20棵極端感病單株,利用BSA(分離群體分組分析)法建立抗病池和感病池,用653對SSR、Indel和SNP標(biāo)記對其進(jìn)行篩選。179棵F_2代植株自交得到179個(gè)F_(2:3)家系,使用分子標(biāo)記與接菌表型進(jìn)行篩選,最終獲得了與抗根腫病緊密連鎖的分子標(biāo)記,對抗病基因進(jìn)行了初步定位。得到以下結(jié)果:1、對72棵F_1代進(jìn)行接菌鑒定,發(fā)現(xiàn)F_1代表現(xiàn)為感病,F_1代自交得到F_2代,在F_2代表現(xiàn)出抗感分離。利用BSA重測序發(fā)現(xiàn),在A01與A08染色體上存在明顯的變異位點(diǎn)。再用179個(gè)F_(2:3)家系接菌,通過接菌結(jié)果發(fā)現(xiàn)F_2的抗病與感病的比例為R∶S=12∶167,卡方檢驗(yàn)χ~2=0.0625.99符合1:15的分離比,因此推斷根腫病抗性由兩個(gè)互為獨(dú)立隱性基因控制,并將A01染色體上的位點(diǎn)命名為BraA.PB.1.2,將A08染色體上的位點(diǎn)命名為BraA.Pb.8.2。2、對179個(gè)F_(2:3)家系進(jìn)行分子標(biāo)記篩選,在653對引物中,有多態(tài)性的引物共113對,其中A01染色體上有17對,A08上有20對,在A01染色體上有6個(gè)SSR標(biāo)記與抗病基因連鎖,上游分別為C230、C228和C141,下游分別為ACMP473、C234和ACMP334,其中兩個(gè)最近的側(cè)翼標(biāo)記為C230與ACMP473遺傳距離為4.9 cM,物理距離為0.44 Mb。在A08染色體上有2個(gè)SSR標(biāo)記和3個(gè)SNP標(biāo)記與抗病基因連鎖,上游分別為S044、C353,下游分別為A08-107、A08-108、A08-106。兩個(gè)最近的側(cè)翼標(biāo)記遺傳距離為11.8 cM,物理距離為2.09 Mb。3、通過對F_(2:3)家系的基因型和表型聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)兩個(gè)基因都是純合時(shí),植株表現(xiàn)為絕對抗病;當(dāng)BraA.PB.1.2純合BraA.Pb.8.2雜合時(shí)或者BraA.PB.1.2雜合BraA.Pb.8.2純合時(shí)抗病性較差,兩個(gè)基因型雜合或者為感病基因型時(shí)則完全感病。再經(jīng)過85棵F_2抗病植株與96棵感病植株的基因型與表型驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)結(jié)果與上述一致,因此證明了兩個(gè)基因?yàn)殡[性純合抗病基因,并且為功能互補(bǔ)、獨(dú)立遺傳兩個(gè)抗病基因。綜上所訴,本研究通過構(gòu)建了F_2代群體,進(jìn)一步獲得了F_(2:3)家系,使用韓國KEL23根腫菌進(jìn)行接種,完成了對抗病品種CR026中含有的抗根腫病基因的初步定位,開發(fā)并驗(yàn)證了與BraA.PB.1.2、BraA.Pb.8.2基因緊密聯(lián)鎖的分子標(biāo)記,這些標(biāo)記可以應(yīng)用到大白菜抗根腫病的選擇中,提供了新的抗源,為今后進(jìn)一步研究抗病基因的分子功能奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S436.341.1
【部分圖文】：

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文19醫(yī)用5ml注射器，以上器具使用前均滅菌處理，每穴播一棵苗，當(dāng)苗長出兩片子葉時(shí)，進(jìn)行接菌，每棵苗接菌1ml，直接注射到小苗的根部，保證接菌質(zhì)量，接菌前控水，避免稀釋菌液，影響接菌效果。c)表型鑒定：接菌45天后進(jìn)行表型鑒定，45天內(nèi)，控制濕度在70%～90%內(nèi)，提高發(fā)病率。根腫菌數(shù)個(gè)/毫升=80小格內(nèi)根腫菌個(gè)數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)2.2.2表型鑒定與分級標(biāo)準(zhǔn)接菌45天后進(jìn)行表型鑒定。2018年上半年對72棵F1進(jìn)行接菌鑒定，使用36棵91-12做接菌對照；2018年下半年選擇其中979棵F2用來做接菌鑒定，使用72棵91-12做接菌對照；2019年下半年對179棵F2:3家系進(jìn)行接菌表型鑒定，每個(gè)家系每次接菌20棵，每個(gè)穴盤播3個(gè)家系，用12棵91-12做對照，兩次重復(fù)。分級標(biāo)準(zhǔn)采用Buczacki等在1975年的分級方法。將發(fā)病等級分為0～3級，0級根部發(fā)達(dá)，無根瘤產(chǎn)生；1級主根無瘤，側(cè)根小瘤；2級主根小瘤，側(cè)根腫瘤較大；3級主根側(cè)根均有大瘤產(chǎn)生，植株萎蔫（如圖1-1）。0級為抗病，1、2、3級為感�。˙uczackietal.，1975）。注：發(fā)病指數(shù)=(∑（各級發(fā)病株數(shù)×相應(yīng)等級數(shù)）)/調(diào)查的總株數(shù)圖1-1接菌鑒定分級情況Figure1-1Inoculationidentificationandclassification

三、結(jié)果與分析26圖3-1F2:3家系抗病性鑒定Figure3-1DiseaseresistanceidentificationofF2:3families3.2BSA數(shù)據(jù)的分析與結(jié)果3.2.1BSA數(shù)據(jù)質(zhì)控測序項(xiàng)目在Illumina測序平臺(tái)上完成，測序數(shù)據(jù)包含一些帶接頭（adapter）、低質(zhì)量的reads，為了防止這些序列對后續(xù)的信息分析產(chǎn)生過多得干擾，對后續(xù)信息分析的質(zhì)量和準(zhǔn)確性提供保證，需要對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步過濾。主要從以下幾點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾：a)接頭污染去除。去除3’端的接頭污染，至少10bpoverlap（AGATCGGAAG），允許20%的堿基錯(cuò)誤率；b)reads過濾。去除含N（N表示無法確定堿基信息）較多（≥10%）的reads；c)質(zhì)量過濾。去除低質(zhì)量的序列（Q≤10的堿基占整體序列堿基數(shù)目的50%以上，即認(rèn)為是低質(zhì)量的序列）。本研究中候選位點(diǎn)的篩選綜合了SNPindex和G_Stats的結(jié)果，對他們選取一定的閾值，篩選共同的顯著位點(diǎn)作為候選位點(diǎn)。其中SNPIndex的閾值設(shè)置為0.95，G_Stats的閾值設(shè)置為Top0.1%（即所有位點(diǎn)中0.1%的位點(diǎn)認(rèn)為是顯著的）3.2.2BSA測序定位BraA.PB.1.2與BraA.Pb.8.2基因本研究中候選位點(diǎn)的篩選綜合了SNPindex和G_Stats（圖3-2）的結(jié)果，對抗病性鑒定

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文27他們選取一定的閾值，篩選共同的顯著位點(diǎn)作為候選位點(diǎn)。其中SNPIndex的閾值設(shè)置為0.95，G_Stats的閾值設(shè)置為Top0.1%（即所有位點(diǎn)中0.1%的位點(diǎn)認(rèn)為是顯著的）。通過兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)共同篩選，共有6720個(gè)位點(diǎn)被篩選出來，變異位點(diǎn)在A08染色體上存在數(shù)目最多且有一處密度最高，在A01染色體上變異位點(diǎn)較少，但有一處密度較高。圖3-2樣本間G_Stats值在染色體上的分布Figure3-2DistributionofG_Statsonchromosomesbetweensamples3.3BraA.PB.1.2與BraA.Pb.8.2基因遺傳圖譜構(gòu)建3.3.1A01染色體多態(tài)性引物的篩選驗(yàn)證與圖譜構(gòu)建在A01染色體上通過對134對SSR標(biāo)記和40對SNP標(biāo)記進(jìn)行篩選，共15對SSR標(biāo)記和6對SNP標(biāo)記在親本之間有多態(tài)性，經(jīng)群體篩選驗(yàn)證后，有5對SSR標(biāo)記與抗病表型連鎖，即C228、C230、ACMP473、C234、ACMP334和C141，這些標(biāo)記長短均在100～200bp之間，在丙烯酰胺凝膠電泳下均有很好的區(qū)分，附表3-3為這些引物的信息。利用JoinMap4.0與Mapchart軟件對A01染色體上的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)C230與ACMP473與A01染色體上的抗病基因較近，遺傳距離分別為1.5cM和3.4cM，兩標(biāo)記之間的物理距離為0.44Mb。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2863961