多房棘球蚴病俗稱泡球蚴病是由多房棘球絳蟲的幼蟲(多房棘球蚴、泡球蚴)寄生于人或動物肝臟所引起的一種人獸共患寄生蟲病,它的成蟲主要寄生于狐貍、狼和犬的小腸內(nèi)。本病主要在北半球高緯度地區(qū)和凍土地帶流行,但隨著世界貿(mào)易和全球化進程的推進,該病有向南半球蔓延的趨勢。它不僅能嚴重危害人體的健康,而且還是一個嚴重的社會經(jīng)濟問題。目前,對于該病的治療主要是以手術(shù)切除為主,藥物治療為輔,但是由于泡球蚴呈腫瘤樣無限浸潤生長,手術(shù)切除后能發(fā)生轉(zhuǎn)移,因此對泡球蚴病的預(yù)防成為流行區(qū)各級政府所優(yōu)先關(guān)心的問題。研究多房棘球絳蟲保護性抗原EM95的免疫保護作用對泡球蚴病疫苗研制與開發(fā)具有十分重要的意義。本研究以NCBI數(shù)據(jù)庫Em95基因序列作為參考序列設(shè)計引物,以多房棘球蚴總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR擴增,獲得Em95基因完整ORF序列,并對該序列進行了相關(guān)的生物信息學分析。結(jié)果表明,EM95蛋白的編碼基因長471 bp,與參考序列的相似性為100%,由156個氨基酸殘基組成,其上有2個N-糖基化位點,N端有一長為16個氨基酸的信號肽序列,C端有由23個氨基酸組成的跨膜區(qū),屬于分泌型糖蛋白。B細胞抗原表位分析表明,EM95有6個潛在的抗原表位,比EG95預(yù)測的抗原表位少一個。將全長的Em95基因和截去編碼信號肽及跨膜區(qū)的Em95基因分別克隆到原核表達載體中并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細胞中,用IPTG誘導使其表達。結(jié)果表明,全長的Em95基因以包涵體形式表達,而截去信號肽及跨膜區(qū)的Em95基因(t Em95)以可溶性蛋白形式表達。將純化后的tEM95重組蛋白免疫BALB/c小鼠(雌性,6周齡),小鼠分為免疫組(首免50μg,以后減半,40只)、佐劑組(40只)和對照組(40只),三次免疫兩周后腹腔接種多房棘球蚴原頭蚴(100個/只)進行攻擊感染,9周后對試驗小鼠進行剖檢,結(jié)果表明EM95重組蛋白對小鼠的保護率為27.58%,減蚴率為60.52%~67.38%。結(jié)論認為,EM95重組蛋白對繼發(fā)性多房棘球蚴病具有一定的保護作用,能明顯抑制多房棘球蚴的生長;本研究為多房棘球蚴病EM95重組抗原疫苗的研制和開發(fā)提供了理論依據(jù)。
【學位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S852.7;Q78
【文章目錄】：
附件
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 前言
    1.1 包蟲病/棘球絳蟲
    1.2 泡型包蟲病/多房棘球蚴
    1.3 EG95/EM95
第二章 多房棘球絳蟲Em95基因克隆及序列分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 多房棘球蚴、菌種及試劑
        2.1.2 引物設(shè)計與合成
        2.1.3 多房棘球蚴的獲取
        2.1.4 原頭蚴總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄
        2.1.5 PCR擴增多房棘球蚴Em95基因
        2.1.6 Em95基因的克隆及測序
        2.1.7 Em95基因序列分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 多房棘球蚴總RNA的提取
        2.2.2 多房棘球絳蟲Em95基因的克隆
        2.2.3 EM95理化性質(zhì)
        2.2.4 EM95信號肽及跨膜區(qū)預(yù)測
        2.2.5 EM95二級結(jié)構(gòu)分析
        2.2.6 抗原表位預(yù)測
        2.2.7 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測
    2.3 討論
第三章 多房棘球絳蟲Em95基因原核表達載體的構(gòu)建及表達
    3.1 實驗材料
        3.1.1 載體與菌株
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
        3.2.2 多房棘球蚴EM95的原核表達及表達形式鑒定
        3.2.3 表達條件優(yōu)化
        3.2.4 重組EM95蛋白純化
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 Em95基因片段的擴增
        3.3.2 重組質(zhì)粒陽性鑒定（PCR）
        3.3.3 Em95和tEm95原核表達
        3.3.4 pET30a-tEm95重組蛋白誘導條件的優(yōu)化
        3.3.5 pET30a-tEm95重組蛋白的純化
    3.4 討論
第四章 重組EM95蛋白免疫小鼠保護力觀察及應(yīng)用
    4.1 材料與方法
        4.1.1 實驗動物、多房棘球蚴及樣品
        4.1.2 主要試劑及溶液
        4.1.3 小鼠的免疫實驗
        4.1.4 ELISA檢測EM95特異性抗體檢測
        4.1.5 EM95重組蛋白保護效力觀察
        4.1.6 EM95重組蛋白的應(yīng)用
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 ELISA檢測
        4.2.2 攻蟲實驗
        4.2.3 EM95重組蛋白保護力檢測
        4.2.4 EM95重組蛋白的應(yīng)用
    4.3 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡歷

【參考文獻】

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本文編號：2854492