本文關(guān)鍵詞：動物源性腸球菌多位點序列分型及質(zhì)粒檢測，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腸球菌是一類球形或卵圓形,不形成芽孢,常以成對或短鏈形式存在的需氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性球菌,且為條件性致病菌,廣泛存在于水、土壤等環(huán)境中,是人和動物體胃腸道正常菌群之一,糞腸球菌和屎腸球菌是其優(yōu)勢菌種。臨床上由于抗生素的濫用,多重耐藥菌株的出現(xiàn),使腸球菌的感染率不斷上升,成為感染的要病原菌。雖然腸球菌被習(xí)慣性認(rèn)為腸球菌是人和動物腸道共生的條件性致病菌,但它們能獲得特定的遺傳性狀,如毒力和耐藥性等因素,這也提高了其在復(fù)雜環(huán)境中的適應(yīng)能力,使得許多耐藥菌株大量出現(xiàn)和蔓延。腸球菌對現(xiàn)有的大多數(shù)抗菌藥物天然耐藥(如青霉素類、頭孢類抗菌藥物),使其不易從感染部位清除。腸球菌易通過點突變和移動遺傳因素獲得耐藥性,最常見的方式是接合或者通過質(zhì)粒的水平傳輸或轉(zhuǎn)座子。有研究表明幾個確定質(zhì)粒無論是位點特異性重組或同源重組轉(zhuǎn)座子能共轉(zhuǎn)移和整合進(jìn)染色體中。腸球菌中質(zhì)粒的流行性和重要性在動物、食品和人的野生型腸球菌耐藥性的傳播中具有重要作用是未知的。質(zhì)粒是可塑的和動態(tài)結(jié)構(gòu),它常被認(rèn)為不同的特定功能如維護(hù)(復(fù)制,穩(wěn)定性和拷貝數(shù)控制),轉(zhuǎn)讓(移動和轉(zhuǎn)移),致病性(致病島和毒力基因),降解途徑(生化特性)和抗性功能(抗微生物,重金屬)。最近的一些研究表明,這些模塊進(jìn)化中保留該宿主特異性。目前,國外對腸球菌致病性的研究較多,而國內(nèi)則較少。由于細(xì)菌的進(jìn)化與所處環(huán)境有著非常密切的關(guān)系,所以不同地區(qū)的菌株會有著自身的特點,然而關(guān)于腸球菌的流行病學(xué)和種群結(jié)構(gòu)知道很少。本研究以90株不同來源腸球菌分離株為研究對象,應(yīng)用多位點序列分型(MLST)技術(shù),根據(jù)GenBank公布的腸球菌基因組上7個不同管家基因設(shè)計特異性引物,糞腸球菌gdh葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、gyd甘油醛-3-磷酸脫氫酶、pstS磷酸ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運、gik葡萄糖激酶、aroE草酸-5-脫氫酶、xpt黃嘌呤磷酸、yiqL乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶;adk(腺苷酸激酶),atpA(ATP合成酶,α亞基),ddl(D-丙氨酸連接酶),gyd(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、pstS(磷酸ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體、purK(烯醇丙酮酸羧化酶ATP酶亞基)。以不同來源的腸球菌DNA為模板,通過PCR擴(kuò)增出各個管家基因,經(jīng)膠回收純化,送公司進(jìn)行測序,測序正確的進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得到等位基因圖譜,構(gòu)建等位基因圖譜并確立序列型(STs),進(jìn)而對90株腸球菌進(jìn)行分型,系統(tǒng)分析菌株間的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系。然后進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)調(diào)查和菌群遺傳分析及流行病學(xué)分析。MLST結(jié)果分析表明腸球菌共54個ST型,其中糞腸球菌和屎腸球菌各占27個ST型。糞腸球菌主要分布在ST16有9株;ST163、ST238和ST631分別4株;ST69、ST138、ST330、ST363、ST597分別有3株,其余各ST型到只包含1或2株菌。屎腸球菌主要分布ST178、ST190分別有2株菌,其余如ST22、ST26等各個ST僅僅包含1株菌。隨后為研究腸球菌其質(zhì)粒攜帶情況,來自腸球菌公布的12種質(zhì)粒序列,根據(jù)其復(fù)制起始基因(rep)進(jìn)行序列比對,使用其蛋白和DNA水平80%的一致性,設(shè)計引物,摸索不同質(zhì)粒的PCR條件,每個質(zhì)粒在所測菌株中進(jìn)行試驗多次篩選直到有菌株中出現(xiàn)某種質(zhì)粒,然后送公司測序,將序列正確的作為陽性質(zhì)粒,再對其它菌株進(jìn)行檢測。如果某種質(zhì)粒在所測菌株中均沒有出現(xiàn),在本實驗中暫定為陰性。本研究對不同來源的65株腸球菌進(jìn)行質(zhì)粒流行性測試結(jié)果表明,rep9家族在糞腸球菌中最普遍,而rep2在是屎腸球菌中最常見;65株糞腸球菌中有8株檢測到質(zhì)粒,所檢測出的質(zhì)粒分別是pIP501(分離株N9、N41),pRE25(N1、N5、20a),pAM373(N5、N10)和pS86(N2、N4),并且分離株N5中攜帶了兩種質(zhì)粒。上述結(jié)果說明動物源性腸球菌分離株中存在質(zhì)粒,但攜帶數(shù)量數(shù)量較少。由于條件所限上述結(jié)果尚需要進(jìn)一步的研究加以證實。
【關(guān)鍵詞】：腸球菌 MLST 測序 質(zhì)粒
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.611
【目錄】：

• 致謝4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 常用縮略詞11-12
• 文獻(xiàn)綜述12-26
• 1.腸球菌概述12-18
• 2.腸球菌的分子生物學(xué)鑒定18-22
• 3.腸球菌質(zhì)粒鑒定的研究22-26
• 試驗一 動物源性腸球菌MLST檢測26-42
• 1 材料26-28
• 2.方法28-31
• 3.結(jié)果與分析31-40
• 4．討論40-42
• 試驗二 腸球菌的質(zhì)粒檢測42-52
• 1 材料42-44
• 2.方法44-48
• 3．結(jié)果與分析48-50
• 4．討論50-52
• 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-61
• 發(fā)表論文61

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 蔣偉;黎滿香;林榮高;田世成;;腸球菌研究進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年05期

2 王亞賓;張祥;胡清林;孟振北;陳麗穎;陳小麗;崔保安;;仔豬關(guān)節(jié)炎糞腸球菌生物學(xué)特性研究[J];河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2011年02期

3 俞道進(jìn);尹兵;易秀麗;馬玉芳;李健;黃一帆;;豬源萬古霉素耐藥腸球菌分離及表型和基因型檢測[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;2011年02期

4 文靜;孫建安;周緒霞;李衛(wèi)芬;;屎腸球菌對仔豬生長性能、免疫和抗氧化功能的影響[J];浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報;2011年01期

5 康孟佼;朱春紅;蔣穎;姚豐華;吳娟;段小麗;朱國強(qiáng);;腸炎沙門菌間接ELISA檢測方法的建立[J];中國家禽;2010年15期

6 王東;唐銘坤;黃震;周芳永;周霞;;致羔羊腦炎糞腸球菌聚集物質(zhì)Asa1基因的克隆與序列分析[J];畜牧與獸醫(yī);2010年05期

7 王中強(qiáng);邱少富;王勇;孫巖松;宋宏彬;;多位點序列分型技術(shù)及其研究進(jìn)展[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2010年01期

8 周霞;王曉蘭;剡根強(qiáng);馬勛;;腸球菌研究進(jìn)展[J];石河子大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2008年06期

9 周霞;王曉蘭;剡根強(qiáng);馬勛;;糞腸球菌抗體間接ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2008年05期

10 劉金華;賀丹;楊艷秋;張波;王麗;;多位點測序分型技術(shù)在病原微生物分型鑒定中的應(yīng)用[J];微生物學(xué)通報;2007年06期

  本文關(guān)鍵詞：動物源性腸球菌多位點序列分型及質(zhì)粒檢測，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：284936