本文關(guān)鍵詞：中國大鯢Sox4a、Sox4b、Sox4c及Sox7基因cDNA序列的克隆和組織表達(dá)分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Sox (SRY-box containing)基因在動物界廣泛存在,目前已在魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類動物中發(fā)現(xiàn)超過100個(gè)成員,根據(jù)HMG盒的相似性,將其劃分為A-K 11個(gè)亞族。Sox4基因是SoxC亞族成員之一,在胚胎發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用,主要參與心臟、淋巴細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌胰島、造血細(xì)胞、性腺等多種器官的發(fā)育。Sox7基因?qū)儆赟ox家族F亞族,主要參與胚胎發(fā)育和細(xì)胞命運(yùn)的決定。Sox7基因不僅能夠誘導(dǎo)Nodal信號分子、中胚層相關(guān)基因以及內(nèi)胚層分化基因的表達(dá),而且是內(nèi)胚層Veg-T信號途徑所需的標(biāo)志物。本研究以中國特有的大型珍稀二級保護(hù)物種,唯一尚存的隱鰓鯢科兩棲動物一中國大鯢(Andrias davidianus)為研究對象,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(]RT-PCR)及cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)克隆獲得中國大鯢Sox4基因的3個(gè)同系物：Sox4a、Sox4b、Sox4c及Sox7基因的cDNA序列,對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并通過熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行各組織間表達(dá)情況的分析,主要取得如下結(jié)果：1. Sox4a基因的cDNA序列為1153 bp,編碼224個(gè)氨基酸,位于59-130之間的HMG-box是其主要功能區(qū),同源性分析表明中國大鯢Sox4a編碼蛋白與其他物種Sox4a蛋白同源性在63.8%-97.2%之間；對不同物種的Sox4a蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可知：鯉魚(Cyprinus carpio)與施氏鱘(Acipenser schrenckii)從進(jìn)化樹最先分出,隨后兩棲類的中國大鯢與飾紋姬蛙(Microhyla ornata)聚成一支,鳙魚(Hypophthalmichthys nobilis)與斑馬魚(Danio rerio)最后分出,說明Sox4a基因是一個(gè)古老的基因,且從中國大鯢到魚類的進(jìn)化速度比較快,Sox4a基因的基因復(fù)制時(shí)間可能在鳙魚與斑馬魚分化之前。Sox4b基因的cDNA序列為1058 bp,編碼193個(gè)氨基酸,位于59-130之間的HMG-box是其主要功能區(qū),同源性分析表明中國大鯢Sox4b編碼蛋白與其他物種Sox4b蛋白同源性在60.3%-97.1%之間；對不同物種的Sox4b蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可知飾紋姬蛙最早從進(jìn)化樹分出,隨后是鯉魚、瓣結(jié)魚(Folifer brevifilis)等幾種魚類,中國大鯢與金線蛙(Pelophylax plancyi)聚成一支最后從進(jìn)化樹分出。Sox4c基因的cDNA序列為996bp,編碼149個(gè)氨基酸,位于59-130之間的HMG-box是其主要功能區(qū), Sox4c基因目前僅在飾紋姬蛙獲得部分核苷酸片段,將其推導(dǎo)蛋白與中國大鯢Sox4c序列進(jìn)行比對,兩者同源性高達(dá)81.7%。2.Sox7基因的cDNA序列長為847bp,編碼188個(gè)氨基酸,位于44-115之間的HMG-box是其主要功能區(qū),中國大鯢Sox7編碼蛋白與其他物種Sox7蛋白同源性在64.1-76.8%之間；對不同物種的Sox7蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可知Sox7基因是一個(gè)比較古老的基因,在魚類、兩棲、爬行、哺乳均有存在,中國大鯢與非洲爪蟾、熱帶爪蟾兩棲類聚在一起基本符合物種進(jìn)化的歷程。3.從NCBI下載、查閱文獻(xiàn)及本實(shí)驗(yàn)室先前所得的中國大鯢Sox基因家族：Sox2、Sox3、Sox4a、Sox4b、Sox4c、Sox7、Sox9、Sox11、Soxl4a、Soxl4b、Sox19共11個(gè)成員。利用MEGA 5.0軟件,采用鄰接法(Neighbor-joining method)重復(fù)1000次對這11個(gè)Sox基因成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示：Sox4a、Sox4b、Sox4c及Soxll匯聚在一起分化出來,顯示其較原始的進(jìn)化地位、Sox9及Sox7聚在一起隨后分出,Sox14的2個(gè)同系物、Sox2、Sox19及Sox3最后分出。4.利用熒光定量PCR方法分析中國大鯢Sox4和Sox7基因的組織表達(dá)情況,結(jié)果顯示：Sox4基因在性成熟的中國大鯢各組織表達(dá)量均比較低,相對而言在腸道表達(dá)量最高,心臟、卵巢、垂體的表達(dá)量次之,肝臟中的表達(dá)量極低,腦及腎臟中幾乎不表達(dá)。Sox7基因在所有檢測的組織中均有表達(dá),且在腎臟中的表達(dá)量最高,腸道、心臟、腦以及卵巢的表達(dá)量次之,垂體中的表達(dá)量較低,肝臟表達(dá)量極低。
【關(guān)鍵詞】：中國大鯢 Sox4a Sox4b Sox4c Sox7 基因克隆 表達(dá)分析
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;S917.4
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 文獻(xiàn)綜述10-20
• 1.1 Sox基因的概述10
• 1.2 Sox基因的成員與鑒定10-11
• 1.3 Sox基因超家族的特點(diǎn)11-12
• 1.4 Sox基因家族分類及功能12-13
• 1.5 Sox基因超家族的進(jìn)化13-14
• 1.6 Sox4和Sox7基因的研究進(jìn)展14-17
• 1.6.1 Sox4基因及其同系物的研究進(jìn)展14-16
• 1.6.2 Sox7基因的研究進(jìn)展16-17
• 1.7 研究目的及意義17-20
• 2 材料和方法20-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物20
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器20
• 2.1.3 試劑及主要試劑的配制20-22
• 2.1.3.1 本研究所用的試劑及菌種20-21
• 2.1.3.2 主要試劑的配制21-22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-35
• 2.2.1 中國大鯢總RNA的提取22-23
• 2.2.2 第一鏈cDNA的合成23-26
• 2.2.2.1 PCR模板的制備23-24
• 2.2.2.2 5’-RACE模板的制備24-25
• 2.2.2.3 3’-RACE模板的制備25-26
• 2.2.3 中國大鯢Sox4基因同系物及Sox7基因保守片段的克隆26-28
• 2.2.3.1 保守引物設(shè)計(jì)及合成26
• 2.2.3.2 保守序列的合成26
• 2.2.3.3 PCR產(chǎn)物的回收26-27
• 2.2.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接反應(yīng)27
• 2.2.3.5 轉(zhuǎn)化及篩選送測27-28
• 2.2.4 中國大鯢Sox4基因同系物及Sox7基因5’-RACE擴(kuò)增28-30
• 2.2.4.1 5’-RACE引物設(shè)計(jì)28
• 2.2.4.2 中國大鯢Sox4基因同系物5’-RACE擴(kuò)增28-29
• 2.2.4.3 中國大鯢Sox7基因5’-RACE擴(kuò)增29-30
• 2.2.5 中國大鯢Sox4基因同系物及Sox7基因3'-RACE擴(kuò)增30-32
• 2.2.5.1 3’-RACE引物設(shè)計(jì)30
• 2.2.5.2 中國大鯢Sox4基因同系物3’-RACE擴(kuò)增30-31
• 2.2.5.3 中國大鯢Sox7基因3’-RACE擴(kuò)增31-32
• 2.2.6 序列分析32
• 2.2.7 熒光定量PCR檢測中國大鯢Sox4和Sox7基因在各組織中的表達(dá)32-35
• 2.2.7.1 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)32-33
• 2.2.7.2 各組織樣品總RNA的提取及cDNA的制備、檢測33
• 2.2.7.3 最適退火溫度的選擇33-34
• 2.2.7.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作34
• 2.2.7.5 熒光定量PCR檢測Sox4和Sox7基因表達(dá)情況34
• 2.2.7.6 數(shù)據(jù)分析34-35
• 3 結(jié)果與分析35-53
• 3.1 中國大鯢總RNA的提取35
• 3.2 中國大鯢Sox4基因同系物保守片段的克隆35-36
• 3.3 中國大鯢Sox4基因同系物cDNA的克隆及序列分析36-45
• 3.3.1 中國大鯢Sox4基因同系物cDNA的克隆36-37
• 3.3.1.1 Sox4基因的5’端cDNA的克隆36
• 3.3.1.2 Sox4基因的3’端cDNA的克隆36-37
• 3.3.2 Sox4a、Sox4b、Sox4c基因的序列分析37-40
• 3.3.3 Sox4同系物蛋白序列比對、同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建40-45
• 3.3.3.1 Sox4同系物蛋白序列比對41-42
• 3.3.3.2 Sox4同系物蛋白同源性分析42-44
• 3.3.3.3 Sox4同系物蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建44-45
• 3.4 中國大鯢Sox7基因cDNA的克隆及序列分析45-50
• 3.4.1 S；ox7基因的cDNA的克隆45-46
• 3.4.1.1 Sox7基因的5’端cDNA的克隆45
• 3.4.1.2 Sox7基因的3’端cDNA的克隆45-46
• 3.4.2 Sox7基因的序列分析46-47
• 3.4.3 Sox7蛋白序列比對、同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建47-50
• 3.4.3.1 Sox7蛋白序列比對47-48
• 3.4.3.2 Sox7蛋白同源性分析48-49
• 3.4.3.3 Sox7蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建49-50
• 3.5 Sox基因超家族進(jìn)化關(guān)系50-51
• 3.6 中國大鯢Sox4和Sox7基因的組織表達(dá)分析51-53
• 3.6.1 熒光定量PCR檢測51-52
• 3.6.2 中國大鯢Sox4基因各組織的差異表達(dá)結(jié)果52
• 3.6.3 中國大鯢Sox7基因各組織的差異表達(dá)結(jié)果52-53
• 4 討論53-58
• 4.1 中國大鯢Sox4同系物及Sox7基因的序列分析53-55
• 4.1.1 中國大鯢Sox4a、Sox4b、Sox4c基因的序列分析53-54
• 4.1.2 中國大鯢Sox7基因的序列分析54-55
• 4.2 Sox基因超家族進(jìn)化關(guān)系分析55-56
• 4.3 中國大鯢Sox4、Sox7基因在各組織中的表達(dá)分析56-58
• 4.3.1 中國大鯢Sox4基因在各組織中的表達(dá)分析56-57
• 4.3.2 中國大鯢Sox7基因在各組織中的表達(dá)分析57-58
• 5 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-64
• 致謝64-65
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄65

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  本文關(guān)鍵詞：中國大鯢Sox4a、Sox4b、Sox4c及Sox7基因cDNA序列的克隆和組織表達(dá)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：284191