【摘要】：透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid, HA)是一種線性、大分子量粘多糖,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。獸疫鏈球菌(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus)是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)HA的主要菌株,研究其生物學(xué)和代謝機(jī)理具有重要意義�；蛘{(diào)控表達(dá)是揭示基因功能的有效手段,對(duì)獸疫鏈球菌尚缺乏基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng),嚴(yán)重阻礙基因功能的研究。本研究以獸疫鏈球菌ATCC39920為研究對(duì)象,報(bào)道四種基于質(zhì)粒調(diào)控的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)：蔗糖、乳糖、木糖和乳酸鏈球菌素(nisin)調(diào)控的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)；并以編碼透明質(zhì)酸合成酶的hasA基因作為報(bào)告基因,以hasA基因功能缺失導(dǎo)致莢膜缺陷的hasA作為宿主菌,觀察誘導(dǎo)后莢膜生成情況驗(yàn)證系統(tǒng)的可行性；依據(jù)AhasA的特性建立可控的兩步法產(chǎn)HA的發(fā)酵模式。主要研究結(jié)果如下：1、構(gòu)建獸疫鏈球菌ATCC39920穩(wěn)定復(fù)制的質(zhì)粒以pSET4s質(zhì)粒為出發(fā)載體,成功構(gòu)建大腸桿菌-獸疫鏈球菌穿梭質(zhì)粒pLH200,其擁有來源于pWV01質(zhì)粒的repA基因和用于篩選的壯觀霉素抗性標(biāo)記。包含pLH200質(zhì)粒的獸疫鏈球菌在無抗生素壓力條件下培養(yǎng)24 h, pLH200質(zhì)粒丟失率為0%,表明此質(zhì)粒用于基礎(chǔ)研究的同時(shí)可避免使用抗生素引起的耐藥性變異。2、構(gòu)建并分析四種誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)以pLH200質(zhì)粒為出發(fā)載體,插入scrR-PScrA調(diào)控元件,構(gòu)建蔗糖誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒,在PscrA下游插入報(bào)告基因hasA,構(gòu)建蔗糖調(diào)控hasA表達(dá)質(zhì)粒pLH200::scrR-PscrA::hasA(pLH201)。分別用lacR-PlacA、xylR-PxylA和nisin-nisR-PnisA調(diào)控元件替換scrR-PscrA構(gòu)建乳糖、木糖、nisin調(diào)控的誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒。四種誘導(dǎo)系統(tǒng)可行性分析表明：乳糖系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)效率低；木糖和nisin系統(tǒng)不能誘導(dǎo)基因表達(dá)；蔗糖系統(tǒng)可嚴(yán)謹(jǐn)且高效誘導(dǎo)基因表達(dá),此誘導(dǎo)系統(tǒng)的成功構(gòu)建為開展獸疫鏈球菌基因功能的研究夯實(shí)了基礎(chǔ)。3、建立可控的兩步法產(chǎn)HA的發(fā)酵模式將pLH201質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入△hasA菌株中,構(gòu)建△hasA/pLH201菌株。此菌株在以葡萄糖為糖源的培養(yǎng)基中不能合成莢膜,解除高粘度發(fā)酵液對(duì)溶氧和基質(zhì)傳遞的限制；其在蔗糖誘導(dǎo)下恢復(fù)合成莢膜的能力。據(jù)此本論文提出可控的兩步發(fā)酵模式：在0.12h添加初始濃度為30 g／L的葡萄糖,意在獲得高密度菌體。在12-24 h添加初始濃度為20g/L的蔗糖,意在誘導(dǎo)合成莢膜,收獲HA。經(jīng)兩步發(fā)酵后,△hasA/pLH201的HA產(chǎn)量為3.4 g／L,而△hasA幾乎檢測(cè)不到HA。△hasA/pLH201生物量為2.7 g／L,期望通過深入研究提高其菌體密度,利用此發(fā)酵模式必將提高HA產(chǎn)量。
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78;S852.611

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本文編號(hào)：2803962